Peut-on parler d'angiogenèse en hématologie ?

ARTICLE

De manière très schématique, l'angiogenèse tumorale est un processus complexe permettant le développement de nouveaux vaisseaux sanguins vers la tumeur en réponse à des facteurs angiogéniques sécrétés par cette dernière. Il existe une corrélation entre le degré de vascularisation d'une tumeur maligne et son potentiel métastatique. Il est maintenant bien montré que l'inhibition des processus d'angiogenèse permet d'inhiber voire de stopper la croissance tumorale. Ainsi, le blocage de l'angiogenèse est devenu un enjeu majeur pour les thérapeutiques anticancéreuses. Contrairement à ce qui se passe pour l'angiogenèse des tumeurs solides, il existe à l'heure actuelle, encore peu de données concernant l'angiogenèse dans les hémopathies. Dans cette revue nous tenterons de faire le point sur ces connaissances.

Quelques données générales sur l'angiogenèse tumorale

Sous l'influence de facteurs angiogéniques sécrétés par les cellules tumorales et le stroma, de nouveaux vaisseaux se développent vers la tumeur pour fournir aux cellules tumorales les nutriments nécessaires à leur développement. Ces facteurs angiogéniques stimulent la production de protéines capables de dégrader la membrane basale et de désorganiser la structure vasculaire. Les cellules endothéliales vont alors migrer vers l'origine du stimulus et amorcer un bourgeonnement du vaisseau parental. Elles vont ensuite proliférer pour permettre l'extension des néo-vaisseaux. Parallèlement, se produit une modification de la matrice extracellulaire pour faciliter l'angiogenèse, et un recrutement des cellules mésenchymateuses afin d'organiser la paroi du néo-vaisseau.

Il existe de nombreux régulateurs de l'angiogenèse dont les plus importants sont notamment le VEGF (vascular endothelial growth factor) et le FGF-2 (basic fibroblast growth factor).

Le VEGF est une glycoprotéine dimérique de 34 à 42 kDa et possédant de 15 à 25 % d'homologie avec le PDGF (platelet-derived growth factor). Le gène du VEGF est localisé en 6p2.3. Plusieurs isoformes du VEGF ont été décrites : 121, 165, 189, 206 et il semble que ce soit la forme 165 qui soit la plus représentée.

L'expression du VEGF est induite par le stress nutritionnel (carence en O₂, en glucose), les facteurs de croissance et la transformation oncogénique. Le VEGF est un facteur de croissance des cellules endothéliales. Il a un rôle dans la prolifération et la migration cellulaire. Il induit également une augmentation de la perméabilité cellulaire in vivo. La surexpression du VEGF dans des tumeurs malignes est corrélée à une augmentation de l'angiogenèse, de la croissance, de l'invasion des tumeurs et à leur capacité à former des métastases. Cela fait de lui une molécule de choix pour une action anti-angiogénique.

Le FGF-2 est membre de toute une famille de protéines capables de moduler l'activité mitogénique, oncogénique et de différenciation d'un grand nombre de cellules dont les cellules endothéliales. FGF-2 est un mitogène bien plus efficace que le VEGF dans l'angiogenèse et ces deux facteurs agissent de concert. Il existe cinq isoformes de la protéine allant de 18 à 34 kDa qui différent par leur localisation cellulaire. La forme la plus commune est celle de 18 kDa ; elle est sécrétée dans le milieu extracellulaire où elle a une action paracrine et autocrine. Les autres formes décrites sont nucléaires. La forme sécrétée est capable de se fixer à l'héparane sulfate et à l'héparine libre. Ainsi, la matrice extracellulaire sert de réservoir de FGF-2 qui peut être libéré par les métalloprotéinases (MPP).

Cellules endothéliales et cellules souches hématopoïétiques

Tant sur le plan ontogénique, histologique, que fonctionnel, il existe une relation entre les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les cellules endothéliales.

Progéniteur commun aux cellules endothéliales et aux cellules hématopoïétiques

Au cours de l'embryogenèse, il existe un progéniteur commun aux cellules souches hématopoïétiques et aux cellules endothéliales responsables de la vasculogenèse (figure) : l'hémangioblaste [1]. La possibilité que cet hémangioblaste soit également présent chez l'adulte et soit capable de migrer et de se différencier est encore en cours d'exploration. Jusqu'à maintenant, il existait plusieurs preuves de l'existence de cellules endothéliales matures circulantes dans le sang périphérique [2]. Plus récemment, des travaux ont montré la présence de progéniteurs endothéliaux au sein de cellules CD34⁺ capables de participer à une angiogenèse dans un modèle d'ischémie tissulaire ou d'épithélialiser une prothèse aortique dans un modèle de transplantation de moelle osseuse chez le chien [3, 4]. Un nouveau marqueur, la glycoprotéine membranaire AC133, a permis d'isoler une population de cellules souches hématopoïétiques. À la différence du CD34, AC133 n'est pas exprimé sur les cellules endothéliales. Ainsi, une sous-population de cellules CD34⁺/AC133⁺ du sang périphérique chez des patients stimulés par du G-CSF a été isolée [5]. Ces cellules, cultivées en présence de VEGF et de SCGF (stem cell growth factor) sont capables de se différencier en cellules endothéliales tout en gardant leur capacité à se différencier en CFU-érythroïde (CFU-E) et en CFU-granulocyte/macrophage (CFU-GM) cultivées en présence de facteurs de croissance hématopoïétiques : SCF (stem cell factor), IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, EPO [5].

Interdépendance cellules hématopoïétiques et cellules endothéliales

La moelle osseuse est irriguée par un réseau très développé de sinusoïdes vasculaires. Ces sinusoïdes reposent sur une membrane basale discontinue voire absente, les cellules endothéliales sont très aplaties et par endroit leur cytoplasme est si mince que la barrière endothéliale est à peine plus épaisse que la couche interne et externe de la membrane plasmique permettant ainsi le passage des cellules sanguines matures vers la circulation sanguine générale. Sur des coupes histologiques, on retrouve des cellules hématopoïétiques et des cellules matures au contact des sinusoïdes. Dans des cultures à long terme de moelle osseuse murine, les cellules endothéliales sont trouvées dans la couche stromale au contact des cellules hématopoïétiques dont elles sont capables d'entretenir l'expansion en synergie avec les facteurs de croissance hématopoïétiques [6]. Cette interdépendance fonctionnelle entre les deux types cellulaires, présente dès l'embryogenèse puisque les CSH sont primordiales au développement de l'angiogenèse embryonnaire, est maintenant un peu mieux connue [7]. Le surnageant de culture de cellules endothéliales est capable de stimuler la différenciation de CFU-GM [8]. Inversement, le G-CSF et le GM-GSF induisent la migration et la prolifération de cellules endothéliales humaines et ont une activité angiogénique dans le modèle de cornée de lapin [9, 10]. En fait, les principaux facteurs de croissance hématopoïétiques (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-3) ont une activité sur la prolifération et le chimiotactisme des CE [11].

Le rôle des facteurs angiogéniques dans l'hématopoïèse

Certains facteurs de croissance des cellules endothéliales impliqués dans l'angiogenèse comme le VEGF, le FGF-2, le HGF (hepatocyte growth factor) ont une activité sur l'hématopoïèse.

L'action du VEGF sur l'hématopoïèse n'est pas clairement établie bien qu'un auteur retrouve une expression de son récepteur sur des CSH [12]. Les données sont contradictoires. Broxmeyer et al. montrent que l'action du VEGF sur la formation de CFU-GM et CFU-E est fonction de leur stade de différenciation tandis que Ratajczak et al. ne retrouvent aucune action [13, 14]. Cependant, le VEGF est capable d'inhiber l'apoptose des CSH induite par irradiation [12].

Concernant le FGF-2, les données de la littérature n'ayant pas été actualisées, son ou ses fonctions seront présentées au conditionnel. Le FGF-2 stimulerait la myélopoïèse dans des cultures longues de moelle en agissant notamment sur la différenciation granulocytaire [15]. Il pourrait être également un mitogène des cellules souches périphériques et des cellules stromales humaines [16, 17]. Il permettrait d'accélérer la mise en place de la couche de cellules stromales lors de la mise en culture de la moelle [15]. Les cellules stromales verraient leur densité augmentée, elles perdraient leur inhibition de contact et pousseraient en multicouche.

Le HGF, ligand naturel du proto-oncogène : C-met, est un facteur de croissance pléitropique possédant une homologie avec le plasminogène et ayant une activité angiogénique in vitro et in vivo. Dans le système hématopoïétique, le HGF est produit par les cellules stromales de la moelle [18]. C-met est retrouvé sur une petite fraction de cellules médullaires CD34⁺ [19]. HGF augmente la croissance de cellules souches hématopoïétiques mais uniquement en synergie avec G-CSF, GM-CSF, EPO et IL-3 [19].

Les données de l'angiogenèse dans les hémopathies

Évaluation de la densité vasculaire dans certaines hémopathies

Il existe des données empiriques laissant supposer que l'angiogenèse a sa place aussi en hématologie. Par exemple, l'efficacité constatée de la thalidomide, un agent anti-angiogénique au mécanisme d'action encore inconnu, dans le traitement du myélome multiple. Mais, contrairement à ce qui se passe pour les tumeurs solides, il y a peu de données dans les études publiées concernant l'angiogenèse en hématologie. Il existe cependant des hémopathies dans lesquelles l'angiogenèse commence à être documentée. Par immunohistochimie sur des biopsies ostéo-médullaires (BOM), une augmentation significative de la densité vasculaire médullaire a été retrouvée dans le myélome multiple [20], les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) [21, 22] et les leucémies aiguës lymphoïdes (LAL) de l'enfant [21]. Dans les lymphomes non hodgkinniens, la densité vasculaire ganglionnaire est également augmentée et corrélée au stade de la maladie [24]. Dans le myélome, la densité vasculaire est plus élevée dans les formes actives par rapport aux formes non actives ou aux gammapathies monoclonales (GM), elle est corrélée à l'index de prolifération [25]. Dans les LAM, il n'existe pas de corrélation entre la densité vasculaire et la blastose médullaire ou les sous-types de la classification French-American-British (FAB) [21, 26].

Les caractéristiques des micro-vaisseaux sont différentes de celles des sinusoïdes de la moelle normale et des vaisseaux rencontrés dans les tumeurs solides. En effet, les vaisseaux sont tortueux souvent sans lumière visible et apparaissent en paquets avec des blastes [23].

Lorsque cela a été possible, l'évolution de la densité vasculaire médullaire au cours du traitement a été évaluée. Sur un groupe de 30 patients porteurs de LAM, dont le suivi par BOM a pu être réalisé (au diagnostic, à J16 de l'induction et en rémission complète), la densité vasculaire après chimiothérapie diminue significativement et ce d'autant plus que la rémission complète est obtenue [26]. En effet, s'il existe une blastose résiduelle la densité vasculaire est significativement plus élevée que sans blastose résiduelle. De plus, après traitement, les vaisseaux encore présents sur les BOM de patients ont un aspect similaire à ceux des BOM contrôles [24]. Cependant, pour les myélomes il ne semble pas y avoir de modification de la densité vasculaire médullaire après autogreffe [27]. Les auteurs vont même jusqu'à suggérer que cette angiogenèse persistante pourrait être en rapport avec une maladie résiduelle non détectable par les méthodes conventionnelles et favoriser la rechute qui est inéluctable dans cette maladie après autogreffe.

Capacité angiogénique des cellules tumorales hématopoïétiques

L'étape suivante a consisté à évaluer si cette augmentation de la densité vasculaire était induite directement par les cellules tumorales ou bien réactionnelle à leur présence. La capacité de surnageants de culture de moelle de patients atteints de myélome à induire une réponse angiogénique a été testée. In vitro, par un test de prolifération des HUVEC (human umbilical vein endothelial cell), 53 % (14/26) de ces surnageants de culture de moelles de myélomes actifs induisent une prolifération contre 11 % (2/18) pour les myélomes non actifs et 15 % (3/20) pour les GM [20]. In vivo, dans un modèle de membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet, 76 % (20/26) des moelles de myélomes actifs sont capables d'induire une réponse angiogénique contre 33 % pour les myélomes non actifs, 20 % pour les GM et 0 % pour les moelles contrôles [20]. Dans un modèle de myélome humain développé chez une souris SCID-hu à partir de cellules de patients injectées directement au niveau d'une portion de fémur humain greffé, Yaccoby et al. montrent qu'il existe une vascularisation active dont le développement est restreint aux aires infiltrées par les cellules myélomateuses et qui est absente chez les souris SCID-hu témoins [28].

Les facteurs angiogéniques dans les hémopathies malignes

Par la suite, différents facteurs angiogéniques dont le VEGF et le FGF-2 ont été recherchés. L'hémopathie la mieux documentée est la LAM où l'augmentation de l'expression de VEGF (soit l'ARNm soit la protéine) est retrouvée dans environs 71 % (20/28 patients) des LAM de novo et dans 60 % (3/5 patients) des LAM secondaires [29]. Il ne semble pas exister de corrélation entre le taux de VEGF et l'âge, le performans status, le taux de globules blancs au diagnostic, la classification FAB, le caryotype, le caractère secondaire de la LAM [22]. Dans le myélome les résultats sont un peu plus controversés. En effet, Bellamy et al. retrouvent en immunohistochimie sur des BOM une expression de VEGF dans 12/16 cas (75 %) [30]. Dankbar et al. ont confirmé ce résultat par Elisa sur des surnageants de culture de moelle osseuse et par RT PCR sur des extraits cellulaires de plasmocytes [31]. Cependant, Vacca et al. ne retrouvent que de faibles taux de VEGF par Elisa sur des surnageants de culture de moelle de myélomes [20].

Le FGF-2, quant à lui, est exprimé par les plasmocytes tumoraux. Son niveau d'expression est significativement plus élevé dans les myélomes actifs par rapport aux myélomes non actifs [20]. De plus, la prolifération d'HUVEC induite par des surnageants de culture de moelle de myélomes est inhibée de 46 % en présence d'anticorps anti-FGF [20].

Enfin, une expression de HGF (ARNm et protéine) est retrouvée dans les myélomes [32]. Or l'activation de son récepteur, C-met, induit à la fois l'invasion, la prolifération et la migration des cellules tumorales et la formation de vaisseaux.

Dans le myélome, la sécrétion d'IL-1beta et de TGF-beta (transforming growth factor-beta) [33, 34] a également été décrite. Or, ces facteurs sont connus comme étant des inducteurs de l'expression de VEGF [35, 36]. De plus, Griffin et al. montrent que l'IL-1beta sécrétée par les cellules blastiques des LAM est capable d'induire l'expression de G-CSF et de GM-CSF par les cellules endothéliales [37].

D'autres acteurs de l'angiogenèse ont été évalués. Certains auteurs se sont intéressés à l'expression de protéines impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire. Ainsi, une augmentation de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) a été retrouvée dans des BOM de LAM en comparaison de BOM normales [38]. Les plasmocytes tumoraux sécrètent des MMP. Barillé et al. rapportent une sécrétion de MMP-9 et Vacca et al. une sécrétion de MMP-2 [20, 39]. Cette activité protéolytique n'est pas régulée par IL-6, OSM, IL-1beta, TNF-alpha, TGF-beta, IL-10 ou dexaméthazone [39]. Dans un modèle de co-culture de cellules stromales et myélomateuses il y a augmentation de sécrétion de MMP-1 par les cellules stromales. Ainsi les cellules myélomateuses sont capables, au sein de l'environnement médullaire, d'induire une activité protéolytique. Dans les lymphomes de haut grade, une expression de MMP-9 est retrouvée. Elle est corrélée à la dissémination systémique et à une survie courte des patients [40]. D'autres auteurs se sont intéressés à l'expression de molécules d'adhésion reconnues par les cellules endothéliales via ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1) et VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) et dont l'expression est induite par les facteurs angiogéniques. Ainsi, l'expression de LFA-1alpha (lymphocyte function associated antigen-1), LFA-1beta, VLA-4 (very late antigen-4), CD44 est significativement plus élevée dans les myélomes actifs comparés aux formes inactives et aux GM. Elle est également significativement plus élevée dans des myélomes en progression par rapport à des myélomes au moment du diagnostic [41].

Le VEGF en hématologie

Le(s) rôle(s) du VEGF ?

Il existe une sécrétion de VEGF dans certaines hémopathies. Très schématiquement, la cellule hématopoïétique tumorale, sous l'influence de signaux encore à déterminer, sécréterait des agents angiogéniques dont le VEGF pour induire une angiogenèse soit à partir des cellules endothéliales existantes soit par différenciation d'hémangioblastes (figure). Mais quel intérêt y aurait il pour les cellules tumorales à synthétiser du VEGF ? Aucun récepteur au VEGF n'est retrouvé sur des plasmocytes tumoraux, l'expression de la neuropilline-1 est à l'étude, un phénomène d'autocrinie ne peut donc, a priori, être envisagé [30]. La possible synergie entre cellules malignes et cellules endothéliales est un modèle plus satisfaisant. Un modèle de croissance tumorale peut être imaginé où les cellules stromales et notamment les cellules endothéliales pourraient, en réponse aux facteurs angiogéniques, favoriser la croissance tumorale en sécrétant des cytokines. Différentes données de la littérature viennent étayer cette hypothèse. Les cellules HUVEC stimulées par VEGF sécrètent M-CSF, G-CSF, IL-6, SCF et de l'oncostatine M [30]. De même les MVEC (microvascular endothelial cell) stimulées par VEGF sont capables de sécréter de l'IL-6 [29]. Inversement la stimulation par IL-6 des lignées myélomateuses (U-266, RPMI-8226, OMP-2) induit une augmentation du récepteur à l'IL-6 et la sécrétion de VEGF [31]. La sécrétion de VEGF par des cellules myélomateuses de patients est augmentée jusqu'à cinq fois en présence d'IL-6 pour 7/12 échantillons. Il n'existe cependant pas de récepteurs du VEGF sur les cellules myélomateuses. Les cellules stromales exprimant fortement VEGFR-2, il ne s'agirait donc pas d'un phénomène d'autocrinie mais plutôt d'un processus de paracrinie. Le VEGF est capable de protéger les cellules blastiques de l'apoptose induite par la chimiothérapie ou par l'irradiation en induisant l'expression de MCL1, un membre de la famille de bcl2 [12].

Mécanismes possibles conduisant à l'expression du VEGF

Contrairement au cas des tumeurs solides, le développement tumoral des hémopathies se fait sous forme d'une nappe non circonscrite. La carence n'est donc pas une explication satisfaisante pour expliquer le développement de nouveaux vaisseaux. Il faut donc envisager d'autres mécanismes en jeu. En prenant comme exemple la sécrétion du VEGF, différents mécanismes d'induction de l'angiogenèse seront discutés dans ce chapitre (figure).

La régulation de l'expression du VEGF se fait à trois niveaux : au niveau transcriptionnel, au niveau post-transcriptionnel sur la stabilisation de l'ARNm, et au niveau traductionnel.

Régulation au niveau transcriptionnel

Les facteurs transcriptionnels dont le rôle dans l'expression du gène du VEGF a été clairement montré sont : HIF-1 (hypoxia inducible factor-1), Sp-1 et AP-2. Ceci ne veut absolument pas dire que ce sont les seuls acteurs de cette régulation. Il existe notamment dans le promoteur du VEGF des éléments de réponse aux facteurs AP-1 et NFkB qui pourraient intervenir dans une augmentation de la transcription du VEGF en réponse à des stimulations par des facteurs de croissance ou des agents de l'inflammation [42].

HIF-1 est un facteur impliqué dans la régulation de l'expression de nombreux gènes activés dans des conditions d'hypoxie dont celui du VEGF. C'est un hétérodimère composé de deux sous-unités alpha et beta. L'expression de HIF-1alpha est induite par l'hypoxie alors que HIF-1beta est constitutif. De plus HIF-1alpha est dégradé activement en normoxie par le proteasome, mécanisme dépendant du suppresseur de tumeur VHL (von Hippel-Lindau).

Une surexpression constitutive de HIF-1alpha est retrouvée dans 13/19 tumeurs testées et pour des tumeurs du sein dans 29 % des tumeurs primitives contre 69 % des métastases associées [43]. Ainsi, la surexpression de HIF-1alpha pourrait être à l'origine de la sécrétion accrue de VEGF par la tumeur.

Sp-1 est un facteur transcriptionnel ubiquiste partenaire de différentes protéines dont le facteur de transcription E2F1, le gardien du génome p53, Rb et également le gène suppresseur de tumeur VHL. AP-2 est un facteur transcriptionnel impliqué dans le développement et la morphogenèse. Dans une variété de systèmes cellulaires, il est clairement montré que les facteurs de croissance et les oncogènes sont capables d'induire l'expression de VEGF. En normoxie, dans un modèle fibroblastique, la voie de signalisation p42/p44 MAP kinase via la région proximale du promoteur fixant Sp-1 et AP-2 joue un rôle clé dans l'activation du promoteur du VEGF [44].

Ainsi, de l'activité de ces facteurs transcriptionnels, trois mécanismes d'induction d'expression du VEGF peuvent être déduits : le premier est la stimulation par des facteurs de croissance, le deuxième est une expression de HIF-1alpha constitutive à la cellule tumorale et le troisième est également une expression d'HIF-1alpha secondaire à une hypoxie. Cependant ce dernier mode d'action, du fait de la physiopathologie des hémopathies, semble moins probable. Cette vue simplifiée de la régulation de la transcription du VEGF peut se compliquer du fait des interactions moléculaires mises en évidence avec d'autres régulateurs de la transcription comme CBP/p300 aussi bien pour Sp1 que pour HIF-1alpha. Ainsi pourquoi ne pas envisager une interaction Sp1/HIF-1alpha par l'intermédiaire de CBP/p300 ou de VHL et ainsi augmenter les probabilités de régulations.

Régulation par stabilisation de l'ARNm du VEGF

L'ARNm du VEGF possède deux longues extrémités 5' et 3' non codantes (5'UTR et 3'UTR). À l'heure actuelle, il existe deux éléments connus de stabilisation de l'ARNm. Une structure en épingle à cheveux en début 3'UTR qui, sous hypoxie, recrute des partenaires protéiques impliqués dans la stabilité et un site de fixation pour le facteur HuR situé de façon plus distale et participant à la stabilisation sous hypoxie [45, 46].

Deux voies de signalisation impliquées dans la stabilisation de l'ARNm du VEGF ont les voies des MAP kinases p38/HOG et JNK qui, stimulées, entraînent le recrutement de partenaires protéiques sur une structure en épingle à cheveux située au centre du 3'UTR [47]. Or, les facteurs d'activation de cette voie sont le stress cellulaire et les protéines de l'inflammation.

Ainsi, se dégage un quatrième mécanisme d'expression du VEGF par l'intervention de médiateurs de l'inflammation comme IL-1beta et TNF-alpha. Dans le myélome, Vacca et al. montrent que l'angiogenèse médullaire est corrélée à l'infiltration médullaire par les macrophages, cellules sécrétant les médiateurs de l'inflammation [48]. De plus, comme cité plus haut les blastes de LAM sont capables de sécréter de l'IL-1beta [37]. Contrairement à l'hypothèse où l'hypoxie serait responsable de l'angiogenèse observée en hématologie, ce mécanisme supposé est plus tentant.

Traduction de l'ARNm

Il semble exister également une régulation de l'expression du VEGF au niveau de la traduction par la présence au niveau du 5'UTR de séquences IRES (internal ribosome entry site), séquences permettant une traduction active sous hypoxie, condition où la synthèse protéique est fortement diminuée [49]. Cependant les voies de signalisation en jeu ne sont pas encore élucidées.

De nombreuses questions sont encore en suspens. Bien que l'angiogenèse tumorale puisse être aussi associée à certaines hémopathies, se développe-t-elle selon le même schéma ? Quels sont les signaux inducteurs de cette angiogenèse ? Une hypoxie et une carence en nutriments est-elle à l'origine du développement de cette angiogenèse ou doit-on plutôt envisager, du fait de relations très étroites entre les cellules endothéliales et les cellules hématopoïétiques tant sur le plan ontogénique, histologique, que fonctionnel, une synergie et une coopération ? Quelles sont les conséquences de cette angiogenèse pour le développement de la maladie ? A-t-elle une valeur pronostic ? Peut-elle être un point d'impact du traitement anti-angiogénique ?

CONCLUSION

Remerciements

Je remercie Jacques Pouysségur pour la relecture de ce manuscrit et pour ses remarques constructives.

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