ARTICLE
Auteur(s) : Richard
Hamelin1,2, Alexandra Chalastanis1,2,
Chrystelle Colas1,2, Jamila El Bchiri1,2,
Dominique Mercier1,2, Ann-Sofie Schreurs1,2,
Virginie Simon1,2, Magali Svrcek1,2,3, Aziz
Zaanan1,2, Claire Borie1,2, Olivier
Buhard1,2, Emilie Capel1,2,3, Habib
Zouali1,2,4, Françoise Praz1,2, Martine
Muleris1,2, Jean-François Fléjou1,2,3, Alex
Duval1,2
1Inserm, UMRS 762, 27 rue Juliette Dodu, 75010
Paris
2Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre
de recherche Saint-Antoine, 75012 Paris
3Hôpital Saint-Antoine, Service d’anatomopathologie,
75012, Paris
4Centre d’étude du polymorphisme humain, 75010 Paris
La première étude mentionnant l’existence d’une instabilité
nucléotidique dans les cancers humains est une communication orale
du groupe de Manuel Perucho lors d’un congrès international sur les
oncogènes à Madrid le 8 avril 1992. Après divers refus de
journaux prestigieux, probablement dus à la grande nouveauté des
faits décrits, ce n’est qu’en juin 1993 que Ionov et al. du
groupe de M. Perucho publient un article dans la revue Nature
décrivant des « mutations somatiques ubiquitaires de séquences
répétées dans les cancers colorectaux » [1], un mois après que
deux autres articles parus dans la revue Science aient relaté le
même phénomène [2, 3]. Ce processus original, associé à la
transformation cellulaire, a été appelé MSI (microsatellite
instability) au cours d’une réunion internationale de consensus
dont le rapport a été publié fin 1998 [4]. En septembre 2007,
une interrogation de la base de données bibliographique PubMed avec
le terme MSI donne plus de 2000 réponses correspondant à des
articles publiés sur le sujet.
Notre unité de recherche Inserm s’intitule « Instabilité
des microsatellites et cancers ». Les chercheurs, médecins,
ingénieurs, techniciens et étudiants qui y travaillent ont une
activité de recherche focalisée sur l’étude des tumeurs MSI. Ils
ont collégialement participé à la rédaction de cette revue,
traitant chacun plus particulièrement le domaine d’expertise dans
lequel il est le plus impliqué.
Gènes responsables du phénotype tumoral MSI
Le système de réparation des mésappariements (système MMR) contrôle
la fidélité de la réplication de l’ADN. C’est un système très
conservé de la bactérie aux mammifères. Chez la bactérie, il est
composé de trois protéines principales, MutS, MutL et MutH. Chez
les mammifères, il existe 5 homologues de MutS (de MSH2 à MSH6), 4
homologues de MutL (MLH1, MLH3, PMS1 et PMS2), tandis que MutH n’a
pas d’homologue connu. MSH2 peut former des hétérodimères avec MSH6
ou MSH3, formant respectivement les complexes MutSα et MutSβ qui
reconnaissent différemment les mésappariements de l’ADN selon leur
nature (mésappariement de bases, insertion/délétion de un ou
plusieurs nucléotides) (figure 1). MLH1 forme des
complexes principalement avec PMS2 (MutLα) et joue un rôle
essentiel dans la réparation des mésappariements (figure 1). D’autres
protéines telles que l’exonucléase 1, le proliferating cell
nuclear antigen (PCNA), des polymérases et des ligases jouent
également un rôle dans ce processus [5].
Qu’elles soient héréditaires (HNPCC) ou sporadiques, les tumeurs
MSI sont toutes déficientes dans le système MMR, consécutivement à
l’inactivation biallélique d’un des gènes majeurs du système (figures 1 et 2).
La conséquence directe de ce défaut fonctionnel est l’accumulation
de mutations dans les cellules tumorales, particulièrement au
niveau de séquences répétées appelées microsatellites. C’est ce
phénomène qui a donné le nom de ce type tumoral appelé MSI
(microsatellite instability). Les microsatellites sont des
répétitions en tandem de motifs de 1 à 5 nucléotides présentes en
très grand nombre et réparties sur tout le génome. Lorsque ces
répétitions sont codantes, leur instabilité est susceptible
d’altérer la fonction des gènes qui les contiennent (voir
ci-après).
Dans les familles HNPCC, environ 90 % des altérations du
système MMR sont des mutations constitutionnelles des gènes MSH2 ou
MLH1. Il est décrit également dans environ 10 % des cas des
mutations germinales de MSH6 et, à un degré moindre, de PMS2. Il
existe une base de données rassemblant toutes les mutations
germinales décrites des gènes MMR (www.insight-group.org). Quelques
cas de méthylation germinale hémi-allélique des promoteurs de MLH1
ou MSH2 ont été rapportés, mais ils sont exceptionnels et rarement
transmissibles.
Dans les tumeurs MSI sporadiques, que ce soit dans les cancers
colorectaux, de l’estomac ou de l’endomètre, l’altération MMR
princeps est l’inactivation de l’expression de MLH1 par méthylation
biallélique du promoteur de ce gène [6]. Il a été montré que seule
la méthylation d’une zone particulière (zone proximale) du
promoteur de MLH1 était corrélée à une perte d’expression de la
protéine [7]. Bien que cette observation ait été publiée en 1999,
la région du promoteur de MLH1 analysée dans plus de 60 % des
200 publications que nous avons examinées, est une région dont la
méthylation n’est pas associée à une inactivation de l’expression
de ce gène [8]. Il faut donc absolument tenir compte de ce fait
lorsqu’on entreprend l’étude de la méthylation du promoteur de
MLH1.
Détermination du statut MSI des tumeurs
Il est maintenant généralement admis que la détermination du statut
MSI des tumeurs est utile pour plusieurs raisons. Cela permet
d’aider à identifier les patients HNPCC pour lesquels les critères
familiaux et/ou cliniques utilisés jusqu’à présent sont peu
sensibles ou peu spécifiques. Cela présente d’autre part un intérêt
clinique puisque plusieurs études ont montré que les patients
porteurs de tumeurs MSI avaient globalement un meilleur pronostic
après chirurgie, et semblaient répondre différemment aux
traitements de chimiothérapie, que les patients ayant des tumeurs
non-MSI (voir ci-après).
A la suite de la découverte du phénomène d’instabilité des
microsatellites (appelé alors RER pour replication error), de
nombreuses équipes ont utilisé divers marqueurs microsatellites
pour déterminer le statut MSI des tumeurs. Cela a conduit à un
ensemble de données et d’articles hétérogènes sur leurs
conclusions, par manque de consensus sur la méthodologie de
dépistage et l’interprétation des résultats [9]. Cette absence de
standardisation a montré la nécessité de mettre en place des
critères internationalement reconnus, et une réunion de consensus a
eu lieu à Bethesda en décembre 1997 pour proposer un panel de
marqueurs microsatellites fiables [4].
Le principe de la caractérisation MSI repose sur l’analyse
comparative des produits d’amplification par PCR, obtenus à partir
de l’ADN tumoral et de l’ADN normal du même patient, de plusieurs
régions contenant des microsatellites. Le panel recommandé par la
réunion de consensus de Bethesda est composé de 5
microsatellites : 2 marqueurs mononucléotidiques,
répétitions d’un seul nucléotide (BAT25 et BAT26) et
3 marqueurs dinucléotidiques, répétitions d’un motif de
2 nucléotides (D5S346, D2S123 et D17S250) [4]. Par définition,
une instabilité sur au moins 2 de ces 5 marqueurs caractérise
une tumeur appelée MSI-H (high). Les tumeurs ne présentant une
instabilité que sur un seul marqueur sont appelées MSI-L (low). Les
tumeurs MSS (microsatellite stable) sont celles ne présentant
aucune instabilité sur les 5 microsatellites. Il n’a jamais
été obtenu de preuves évidentes et définitives de l’existence
réelle des tumeurs MSI-L qui ne se différencient pas, ou peu, aux
niveaux moléculaires et cliniques des tumeurs MSS. Dans la suite de
cette revue, nous ne considérerons donc que les tumeurs MSI-H,
appelées MSI, et les tumeurs MSI-L et MSS seront appelées non-MSI
ou MSS.
Les critères pour reconnaître les tumeurs MSI ont été révisés en
2002, à la suite de plusieurs études mettant en évidence un certain
nombre de défauts du panel proposé, concernant notamment
l’utilisation des marqueurs dinucléotidiques [10]. Le panel
original de Bethesda n’est pas déconseillé, mais il est maintenant
suggéré d’utiliser en priorité des marqueurs mononucléotidiques
pour identifier les tumeurs MSI. Un panel de 5 marqueurs
mononucléotidiques (BAT25, BAT26, NR21, NR24 et NR27),
préalablement mis au point par notre groupe [11], a été recommandé
[10]. Outre une extrême sensibilité et spécificité, il a l’avantage
d’être constitué de marqueurs quasi-monomorphes (c’est-à-dire
présentant très peu de variants de taille) dans la population
mondiale, si bien que l’analyse comparative de l’ADN
constitutionnel des patients n’est, en règle générale, pas requise
[12]. Dans ce contexte, comme il existe tout de même quelques
variants alléliques de ces marqueurs, une tumeur ne doit être
considérée comme MSI que si elle montre une instabilité sur au
moins 3 de ces 5 microsatellites mononucléotidiques. Pour
certaines localisations tumorales, dans lesquelles l’instabilité
des microsatellites est moins prononcée, conduisant à des
variations de taille de ces marqueurs plus discrètes et plus
difficiles à identifier (endomètre par exemple), une comparaison
avec l’ADN normal correspondant des patients reste recommandée
[13].
Une alternative à l’allélotypage de microsatellites est
l’immunohistochimie. En effet, le phénotype MSI est dû, dans la
plupart des cas, à l’absence d’expression d’un des gènes majeurs du
système MMR à cause d’une altération génétique ou épigénétique
(voir ci-dessus). L’immunohistochimie permet donc la détermination
indirecte du statut MSI des échantillons étudiés par la mise en
évidence de cette absence d’expression dans la cellule tumorale,
les cellules normales contaminantes ou infiltrantes faisant
fonction de contrôle interne d’expression [14]. Pour être complète,
cette analyse nécessite l’emploi de 4 anticorps dirigés contre
MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2. Cette démarche méthodologique est
considérée comme étant moins lourde et moins coûteuse que
l’allélotypage des microsatellites, et est utilisée en routine dans
de nombreux laboratoires d’anatomopathologie pour faire le
diagnostic MSI des tumeurs. Mais, contrairement à l’analyse de
répétitions mononucléotidiques par PCR, l’immunohistochimie est
difficile à standardiser et nécessite une grande expérience des
expérimentateurs pour être fiable [15]. Enfin, l’immunohistochimie
ne permet pas l’identification des cas porteurs d’une mutation faux
sens, pouvant entraîner une perte de fonction d’un gène MMR, sans
diminuer systématiquement le taux d’expression du gène concerné.
Cependant comme l’immunohistochimie a l’avantage de
« cibler » le gène MMR en cause, elle facilite la
recherche de mutation constitutionnelle de ce gène dans les
familles HNPCC. L’idéal serait donc d’effectuer sur tous les
échantillons tumoraux à la fois l’immunohistochimie et l’analyse
des microsatellites, ces deux techniques donnant des résultats
analogues dans la majorité des cas.
Conséquences cliniques du défaut MMR des tumeurs MSI
Reconnaissance des cas héréditaires
Le syndrome HNPCC est une prédisposition héréditaire au cancer de
transmission autosomique dominante. Il explique de 2 à 7 % des
cas de cancers colorectaux [16]. Il est lié, comme nous l’avons vu,
à une altération constitutionnelle d’un des gènes MMR,
principalement MLH1 ou MSH2, plus rarement MSH6 ou PMS2. La
survenue d’un événement somatique inactivant le second allèle du
même gène MMR dans une cellule conduit à une instabilité génétique
augmentant le taux de mutations sur l’ensemble du génome, et peut
favoriser l’émergence d’une prolifération cellulaire MSI et la
transformation de ces cellules.
La pénétrance de ce syndrome est élevée avec 70 à 80 % de
risque de cancer colorectal cumulé pour les hommes et 40 à
60 % pour les femmes. Le risque ne se limite pas au côlon
puisque les femmes ont également un risque cumulé de cancer de
l’endomètre de plus de 40 % [16, 17]. D’autres localisations
plus rares peuvent être observées. On retient comme faisant
également partie du spectre HNPCC les tumeurs des voies urinaires,
de l’intestin grêle, de l’estomac, des voies biliaires, des
ovaires, du pancréas, les tumeurs cérébrales, ainsi que quelques
proliférations bénignes telles que les adénomes sébacés et les
kératoacanthomes [18].
Historiquement, l’identification des patients HNPCC était basée
exclusivement sur des données cliniques d’histoire personnelle et
familiale très spécifiques mais peu sensibles (critères d’Amsterdam
de type I puis II) [18, 19]. Beaucoup de patients porteurs de
mutations constitutionnelles sur un gène MMR, et donc HNPCC,
n’étaient pas identifiés par ces critères. Ces critères cliniques
ont été élargis lors des conférences de Bethesda en 1997 puis en
2004, permettant la sélection de patients pour lesquels on propose
une recherche de phénotype MSI tumoral préalablement à l’analyse
constitutionnelle des gènes MMR, augmentant ainsi la sensibilité du
dépistage [10, 20] (tableau 1). En
France, un consensus de biologistes a même retenu le principe d’un
phénotypage MSI systématique sur toutes les tumeurs colorectales
diagnostiquées avant 61 ans indépendamment de leurs
caractéristiques histologiques et de l’histoire familiale [17].
En présence d’une tumeur colorectale MSI, et après avoir
« ciblé » par immunohistochimie le gène MMR portant
potentiellement une altération, on identifie une mutation
constitutionnelle chez environ 60 % des patients. Le
pourcentage d’identification est variable selon qu’il existe une
extinction de MSH2 ou MSH6 (respectivement 92 et 90 % de
mutation identifiée) ou de MLH1 (48 % de mutation identifiée).
En effet, il faut rappeler que les tumeurs perdant MLH1 peuvent
être d’origine sporadique à la suite de la méthylation du promoteur
de ce gène.
L’indication d’une analyse constitutionnelle des gènes MMR doit
donc prendre en compte des éléments cliniques et biologiques. Un
arbre décisionnel reprenant ces éléments est disponible dans les
recommandations françaises [17]. Lorsqu’une analyse
constitutionnelle est envisagée elle doit être faite, dans la
mesure du possible, chez une personne atteinte de cancer. Ce
premier patient analysé dans la famille est nommé cas index. Cette
première analyse est longue (6 à 12 mois, voire plus) mais
elle est facilitée par les résultats de l’immunohistochimie qui
indiquent le gène le plus probablement muté et permet donc
d’orienter la recherche de mutations. Il est à noter que les gènes
MMR, et particulièrement MSH2, peuvent présenter des délétions
constitutionnelles d’un ou plusieurs exons, qui doivent être
recherchées lorsque des mutations constitutionnelles ponctuelles
n’ont pas pu être mises en évidence.
Lorsqu’une mutation constitutionnelle est identifiée chez un cas
index, cela permet dans un second temps de proposer une recherche
de cette mutation chez les apparentés indemnes ou atteints de
cancer. Cette analyse est beaucoup plus rapide (1 à 2 mois)
car elle est ciblée sur la mutation familiale. L’identification des
sujets porteurs de la mutation permet de leur proposer une
surveillance adaptée à leur haut niveau de risque. Cette
surveillance repose principalement sur la réalisation de
coloscopies avec coloration à l’indigo carmin tous les 2 ans
dès l’âge de 20 ans [17]. Elle réduit de façon significative
l’incidence du cancer colorectal et la mortalité associée. La
surveillance gynécologique est moins codifiée et n’a pas fait la
preuve de son efficacité. Elle repose principalement sur
l’échographie associée ou non à l’hystéroscopie à un rythme annuel
à partir de 30 ans. Tout saignement anormal avant ou après la
ménopause doit être exploré. Les autres localisations, plus rares,
ne justifient pas une surveillance systématique mais tout symptôme
doit donner lieu à une exploration approfondie.
Il est à noter que, parmi les familles qui répondent aux
critères (restrictifs) d’Amsterdam, il existe des patients dont les
tumeurs ne sont pas MSI et qui ne portent aucune mutation
constitutionnelle d’un gène MMR. Il s’agit probablement de cancers
du côlon héréditaires mais pour lesquels on ne connaît pas pour
l’instant les gènes de prédisposition. Ces cas ont été regroupés
récemment sous le terme de syndrome X [21]. Enfin il existe des
patients héritant de deux mutations constitutionnelles différentes
d’un même gène MMR [22, 23]. Le terme de Lynch III a été proposé
pour ces patients qui présentent des pathologies hématologiques et
cérébrales dans les premières années de leur vie, ainsi que des
manifestations typiques de neurofibromatose de type 1 (NF1) [24,
25].
Tableau 1 Critères de Bethesda révisés [10]
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Les tumeurs doivent être analysées pour leur statut MSI dans les
cas suivants :
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1. Cancer colorectal diagnostiqué avant 50 ans
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2. Présence d’au moins 2 tumeurs du spectre large synchrones ou
métachrones quel que soit l’âge.
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3. Cancer colorectal d’histologie évocatrice* d’un phénotype MSI
diagnostiqué avant 60 ans.
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4. Patient atteint de cancer colorectal ayant un apparenté au
premier degré atteint d’une tumeur du spectre large, l’une des
tumeurs ayant été diagnostiquée avant 50 ans
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5. Patient atteint de cancer colorectal ayant 2 apparentés ou plus
au premier ou deuxième degré atteint d’une tumeur du spectre large,
quel que soit l’âge.
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*Lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), réaction
lymphocytaire de type Crohn, cellules mucineuses en bague à chaton
ou aspect médullaire.
Pronostic tumoral et réponse aux traitements de
chimiothérapie
Les tumeurs MSI sporadiques présentent des caractéristiques
anatomocliniques particulières : il s’agit de tumeurs plus
volontiers localisées au niveau du côlon droit, peu différenciées,
mucineuses ou en bagues à chaton, largement nécrosées, avec de
nombreux lymphocytes intra-épithéliaux, un aspect dit de type
Crohn, avec de nombreux nodules lymphoïdes et un front d’invasion
expansif [26]. De nombreuses études ont analysé la relation
existant entre le statut MSI et la survie des patients, avec des
résultats généralement concordants. Dans une revue systématique de
32 études comportant 7642 cas de cancers colorectaux
(dont 1277 MSI), Popat et al. [27] ont combiné les données
publiées pour confirmer de manière significative que les tumeurs
MSI étaient globalement associées à un meilleur pronostic que les
tumeurs MSS.
L’impact du phénotype MSI sur la réponse aux différents
traitements de chimiothérapie a également fait l’objet de plusieurs
études in vitro et in vivo. Les études réalisées in vitro concluent
à une résistance des cellules MSI aux effets cytotoxiques du
5-fluoro-uracile (5FU). Concernant l’impact du phénotype MSI sur la
réponse des patients atteints de cancer colorectal et traités par
5FU, les premières études ont abouti à des résultats
contradictoires. Il semble maintenant clairement établi que ce
traitement ne bénéficie pas aux patients ayant une tumeur MSI avec
envahissement locorégional (stades II ou III), et pourrait même
être délétère pour ces patients [28]. À l’inverse, les lignées
cellulaires dérivées de cancers MSI sont hypersensibles à certains
agents génotoxiques provoquant des cassures double brin, comme la
camptothécine, inhibiteur de topo-isomérase I, l’étoposide,
inhibiteur de topo-isomérase II ou la bléomycine, agent
radiomimétique [29, 30]. La pertinence de ces observations obtenues
in vitro a été confirmée dans une étude clinique montrant que les
patients atteints de cancer colorectal métastatique étaient plus
susceptibles de répondre favorablement à un traitement par
irinotecan, un analogue de la camptothécine, si leur tumeur était
de phénotype MSI [31].
Conséquences moléculaires du défaut MMR des tumeurs MSI
Conséquences directes
Gènes cibles d’instabilité
Comme nous l’avons vu, les séquences répétées de type
microsatellite représentent un site privilégié de l’instabilité
génétique des tumeurs MSI. De telles séquences sont très nombreuses
et dispersées dans tout le génome. L’immense majorité d’entre elles
se trouve localisée dans des régions intergéniques non codantes de
l’ADN, sans qu’aucune conséquence de leur instabilité ne soit
connue pour l’instant.
Mais il existe également des séquences répétées localisées dans
les exons de certains gènes humains. Il s’agit généralement de
répétitions mononucléotidiques d’une taille comprise entre 6 et 10
nucléotides. Les mutations survenant à leur niveau dans les cancers
MSI sont le plus souvent des délétions ou des insertions de 1 ou
2 bases, et on parle alors de gènes cibles d’instabilité. La
conséquence de telles altérations est un décalage du cadre de
lecture conduisant à la production d’une protéine tronquée (figure 1). On
considère que l’inactivation d’un gène MMR n’est pas transformante
par elle-même mais que c’est l’accumulation de nombreuses mutations
au niveau de gènes cibles d’instabilité qui est responsable du
processus tumoral MSI. Le premier gène cible impliqué dans la
carcinogenèse MSI a été le gène codant pour le récepteur de
type II du TGFβ (TGFβ-RII) [32]. De nombreux gènes cibles
d’instabilité, mutés à des fréquences très variables, sont connus
aujourd’hui [33] (figure
2). Ils sont impliqués dans différentes voies de
signalisation comme la transduction du signal, l’apoptose et
l’inflammation, la régulation de la transcription, la signalisation
des dommages de l’ADN et leur réparation. Bien que les défauts MMR
soient différents entre les cas MSI héréditaires (mutation
constitutionnelle d’un des gènes MMR) et sporadiques (méthylation
du promoteur de MLH1), il ne semble pas qu’il y ait, pour une même
localisation tumorale, de différences fondamentales dans le
répertoire de gènes cibles d’instabilité dans ces deux cas. Par
contre, les gènes cibles d’instabilité sont tissu-spécifiques
puisqu’ils sont différents entre les tumeurs MSI
gastro-intestinales et les tumeurs MSI de l’endomètre par exemple
[33, 34].
Le problème actuel n’est plus de découvrir de nouveaux gènes
cibles mutés dans les cancers MSI, mais de déterminer ceux qui
jouent un rôle important au cours de l’induction et de la
progression tumorale. La carcinogenèse est un processus continu de
mutations et de sélections favorisant en général la croissance
cellulaire. On estime généralement qu’un gène cible susceptible
d’intervenir dans la tumorogenèse MSI est sélectionné au cours de
la progression tumorale et est muté à haute fréquence dans ces
cancers. A l’opposé, les gènes ayant une faible fréquence de
mutations sont considérés comme peu pertinents et sont le témoin du
bruit de fond d’instabilité qui caractérise les tumeurs MSI.
Diverses études ont tenté de différencier par des approches
statistiques les vrais gènes cibles d’instabilité, de ceux
correspondant au bruit de fond d’instabilité des tumeurs MSI [35,
36].
D’un point de vue fonctionnel, l’effet oncogénique de ces
altérations reste à démontrer dans la majorité des cas. Lorsque ces
répétitions sont localisées en début de séquence codante, il est
probable que la protéine correspondante n’est plus fonctionnelle,
et la mutation est supposée être de type « perte de
fonction ». Dans les cas où les répétitions sont présentes
plus en 3’, d’autres répercussions fonctionnelles doivent alors
être évoquées (effet dominant négatif, gain de fonction). Quelques
rares gènes cibles ont été étudiés d’une manière approfondie pour
les conséquences fonctionnelles des mutations qu’ils contiennent.
Parmi ceux-ci, on retrouve TGFβ-RII, ACVRII (activin receptor type
II), MSH3, MSH6, BAX, RIZ (retinoblastoma protein interacting zinc
finger), MBD4 (methyl-CpG binding domain protein 4) et
TCF4.
Répétitions potentiellement régulatrices
Les mutations affectant les séquences répétées situées dans les
régions codantes ont été largement documentées (voir ci-dessus). On
ne peut pas exclure le fait que des séquences répétées situées dans
les régions non codantes intragéniques (introns, régions
transcrites non traduites en 5’ et en 3’), pourraient
également contribuer à la carcinogenèse MSI en influençant la
régulation de l’expression des gènes qui les contiennent.
Deux exemples évoquant la possible implication de répétitions
introniques dans la carcinogenèse MSI sont connus. Une séquence
répétée T19 située dans l’intron 1 de l’oncogène MYB joue un
rôle atténuateur de l’élongation de la transcription de ce gène
dans les cellules normales du côlon. Une surexpression de MYB a été
observée dans les tumeurs MSI, et serait due à l’instabilité de
cette répétition [37]. L’instabilité d’une séquence répétée
intronique localisée en 3’ de l’intron 4 du gène MRE11, à proximité
du site accepteur d’épissage, a été associée à un épissage aberrant
donnant naissance à une protéine tronquée dans les cancers MSI
[38]. Ce défaut est corrélé à une diminution de l’expression du
complexe MRN (MRE11/RAD50/NBS1) qui joue un rôle crucial dans la
réponse cellulaire en cas de cassure double brin de l’ADN.
Par ailleurs, certaines répétitions non codantes situées dans
les régions 5’ et 3’ transcrites et non traduites contribuent
probablement à la régulation de l’expression génique. Il s’agit
principalement de répétitions mononucléotidiques qui, dans certains
cas, sont moins polymorphes que des répétitions de même nature
situées dans des régions non codantes intergéniques [39]. Cette
conservation peut être la conséquence d’une pression de sélection
reflétant un rôle fonctionnel dans l’expression génique. Mais il
n’existe à ce jour aucune preuve fonctionnelle du rôle de
l’instabilité de ces séquences dans le développement tumoral
MSI.
Conséquences indirectes
De nombreux ARN messagers comportant des mutations non-sens sont
générés en conséquence de l’instabilité des répétitions codantes
décalant la phase de lecture des gènes. Ces ARNm donnent naissance
à des protéines tronquées ayant une extrémité C-terminale aberrante
(figure 1). De
telles protéines mutantes peuvent posséder des propriétés
néo-antigéniques et être à l’origine du déclenchement d’une réponse
immunitaire spécifique de l’hôte [40]. Les cancers MSI sont
d’ailleurs connus pour être des tumeurs généralement très
immunogènes et on sait que l’intensité du processus immun
antitumoral est positivement corrélé au bon pronostic des tumeurs
MSI chez l’homme.
Par ailleurs, il existe un mécanisme physiologique appelé NMD
(nonsense mediated mRNA decay) qui est un système de maintenance de
la transcription dégradant les ARN messagers possédant dans leur
séquence un codon stop prématuré (PTC) (figure 1) [41]. Le NMD est
un mécanisme présent chez tous les eucaryotes, qui permet à la
cellule de se prémunir des effets dominants négatifs et gains de
fonction potentiellement délétères des protéines anormales
tronquées générées par les ARNm contenant un PTC. Notre équipe a
comparé le niveau d’expression de gènes cibles d’instabilité dans
une série de lignées cellulaires MSI selon qu’elles comportaient
une mutation homozygote, hétérozygote ou pas de mutation dans les
répétitions codantes correspondantes. Il a été observé que le
niveau d’expression de ces transcrits était très variable d’un gène
à l’autre. Après inhibition in vitro du NMD, certains d’entre eux
étaient réexprimés et d’autres non. Ces résultats suggèrent une
dégradation différentielle et incomplète des transcrits mutants
contenant un PTC dans la cellule tumorale MSI [42]. Il est attendu,
en conséquence, que le NMD puisse avoir un impact significatif sur
l’expression de nombreux mutants dans la cellule tumorale MSI. Nous
avons proposé qu’il pourrait notamment influer sur la sélection de
certaines altérations cibles en modulant leur effet fonctionnel,
soit en l’accentuant (absence de dégradation de mutant dominant
négatif par exemple), soit au contraire en l’annihilant
(dégradation de mutant gain de fonction).
Autres mécanismes oncogéniques associés au type MSI
Altérations génétiques non liées à une instabilité des
microsatellites
Il est connu que les gènes suppresseurs de tumeurs APC et p53,
fréquemment mutés dans les cancers colorectaux présentant une
instabilité chromosomique (voir ci-après), le sont rarement dans
les cancers MSI [43, 44]. Par contre, on retrouve des mutations de
l’oncogène KRAS à la fois dans les tumeurs MSI et MSS, mais avec
une fréquence moins importante dans les tumeurs MSI [45]. Il semble
en outre qu’il existe des différences de fréquence et de type de
mutation de certains gènes selon que les tumeurs MSI sont
sporadiques ou héréditaires [45]. Des mutations de l’oncogène BRAF,
une sérine-thréonine kinase impliquée dans la voie de signalisation
RAS/RAF/MAPK, sont présentes dans environ 35 % des tumeurs MSI
et 5 % des tumeurs MSS colorectales [46]. Parmi les tumeurs
MSI, seules les tumeurs MSI sporadiques, méthylées sur MLH1,
peuvent présenter une mutation de BRAF, alors que celle-ci n’est
jamais retrouvée dans des tumeurs HNPCC [47], si bien qu’il a été
proposé que la présence de cette mutation pouvait permettre
d’exclure le diagnostic de syndrome HNPCC [48]. Inversement, des
mutations de la β-caténine, impliquée dans l’importante voie de
carcinogenèse colorectale APC-β-caténine-TCF (également appelée
voie Wnt-wingless), semblent être plutôt associées aux tumeurs MSI
HNPCC qu’aux tumeurs MSI sporadiques [49]. Les mutations de ces
différents gènes dans les tumeurs MSI ne sont pas localisées au
niveau de séquences répétées codantes et ne découlent donc pas
directement du processus d’instabilité des microsatellites. Elles
peuvent être cependant la conséquence de l’instabilité
nucléotidique générale caractérisant ces tumeurs.
Instabilité chromosomique modérée
Dans la littérature, les tumeurs MSI sont souvent opposées aux
tumeurs dites CIN (chromosomal instability) qui montrent une
instabilité chromosomique souvent très importante caractérisée par
la coexistence de nombreux réarrangements des chromosomes au sein
d’une même tumeur. Il est généralement admis que les tumeurs MSI
représentent 15 % des cancers colorectaux et que les cancers
CIN représentent les 85 % restant. La caractérisation des
tumeurs MSI se fait selon des critères internationaux et il est
maintenant facile de déterminer si une tumeur est MSI ou MSS. Par
contre, il n’y a pas à ce jour de consensus ni sur la technique à
utiliser ni sur le taux minimal d’instabilité chromosomique requis
pour définir le phénotype CIN. Dans une premier temps, il a été
considéré que toutes les tumeurs MSS étaient CIN, ce qui n’est pas
le cas puisque certaines tumeurs MSS ne présentent pas
d’instabilité chromosomique [50]. Il a d’autre part été démontré
que des tumeurs MSI pouvaient présenter une instabilité
chromosomique modérée (voir ci-après).
D’une manière générale, les études cytogénétiques permettent de
mettre en évidence des remaniements et malségrégations
chromosomiques conduisant à des déséquilibres récurrents et non
aléatoires dans les tumeurs. Par la description des régions
chromosomiques fréquemment perdues ou gagnées, la cytogénétique a
permis d’orienter les études moléculaires ultérieures vers
l’identification de nouveaux gènes suppresseurs de tumeurs ou
oncogènes, respectivement. Fearon et Vogelstein en ont déduit un
modèle de progression tumorale colorectale impliquant l’activation
d’oncogènes par mutation ponctuelle ou amplification et
l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur par mutation et
pertes alléliques [51].
Avec l’avènement de la cytogénétique moléculaire (FISH, CGH et
CGH-array), il a été possible de montrer que les tumeurs MSS
étaient, pour leur majorité, aneuploïdes (c’est-à-dire présentent
un contenu anormal d’ADN). Elles sont caractérisées principalement
par des pertes de chromosomes entiers et des délétions de certaines
régions chromosomiques (-18, -17p, -1p, -8p, -5q, -14, -15)
associés à quelques gains (+20q, +13q, +8q, +7). L’ensemble de ces
altérations conduit globalement à une diminution du nombre de
chromosomes (hypodiploïdie). Ces tumeurs ont une forte tendance à
subir des endoreduplications et à passer à l’hypotétraploïdie.
A l’opposé, les tumeurs MSI sont généralement considérées comme
diploïdes et stables du point de vue chromosomique. L’analyse
cytogénétique de plus d’une centaine de tumeurs MSI,
essentiellement coliques, a été rapportée dans la littérature. La
compilation de ces données montre que 40 % de ces tumeurs ne
présentent effectivement aucune altération chromosomique. Mais
60 % des tumeurs présentent un caryotype anormal (Chalastanis
et al., analyse non publiée). Les altérations chromosomiques mises
en évidence sont certes globalement moins fréquentes que dans les
tumeurs MSS, mais réelles, les gains étant plus fréquents que les
pertes. Certains gains semblent être retrouvés de façon récurrente
(+13, +20, +8, +8q, +7, +12) ce qui suppose qu’ils ont été
sélectionnés au cours de la progression tumorale. Ainsi l’ensemble
des anomalies retrouvées dans les tumeurs MSI diffère de celles
observées dans les tumeurs MSS, par leur plus faible fréquence mais
aussi par leur nature. La majorité des tumeurs MSI présente donc un
certain degré d’instabilité chromosomique montrant ainsi que
contrairement à ce qui est généralement admis, les phénotypes MSI
et CIN ne sont pas totalement mutuellement exclusifs. Il reste
maintenant à découvrir le rôle fonctionnel que peut avoir
l’instabilité chromosomique au cours du processus de transformation
cellulaire MSI puisque aucune étude n’a encore porté sur ce point
en particulier.
Méthylation des promoteurs ou type CIMP
Dans les cellules de mammifères, la méthylation de l’ADN intervient
principalement au niveau des cytosines des dinucléotides CpG. Les
régions riches en CpG, appelées îlots CpG, sont souvent associées à
des promoteurs (60 % des gènes en contiennent) et sont
généralement non méthylées dans les cellules normales. La
méthylation des promoteurs est un mécanisme important
d’inactivation de l’expression des gènes et un nombre croissant de
séquences promotrices sont décrites comme étant méthylées dans les
cancers humains. Il a été proposé qu’il existe des tumeurs
colorectales accumulant de telles modifications épigénétiques. Cela
caractérise un phénotype appelé CIMP (CpG island methylator
phenotype) [52]. Le phénotype CIMP ne semble pas exclusif des types
CIN et MSI, mais n’est cependant pas encore bien défini. En
l’absence d’un consensus internationalement reconnu pour mettre en
évidence les tumeurs CIMP, deux panels différents de promoteurs
sont actuellement analysés : celui proposé par le groupe de
J.-P. Issa (MLH1, P16, Mint1, Mint2 et Mint31) [52] et celui
proposé plus récemment par le groupe de P. Laird (CACNA1G,
IGF2, NeuroG1, SOCS1, RUNX3) [53]. Une tumeur est considérée comme
CIMP si au moins 3 des promoteurs du panel analysé sont méthylés.
Cette analyse a permis de dégager quelques caractéristiques
probables des tumeurs CIMP, mais cela n’est pas définitivement
établi du fait de la difficulté à reconnaître ce type tumoral d’une
manière non ambiguë. Ces caractéristiques sont les suivantes :
- – la plupart des tumeurs MSI sporadiques seraient CIMP
(leur défaut de système MMR est la méthylation du promoteur de
MLH1) ;
- – les tumeurs MSI HNPCC ne seraient pas CIMP ;
- – les tumeurs CIMP non-MSI ne seraient pas instables sur
les chromosomes.
Il a même été évoqué que le bon pronostic des tumeurs MSI
pourrait en fait être attribuable au fait qu’elles soient
généralement de phénotype CIMP. Que le type CIMP existe ou non est
encore une question ouverte puisque certains auteurs ont mis en
doute la réalité de ce type tumoral [54]. Cependant, il n’est pas
douteux que l’inhibition de l’expression d’un certain nombre de
gènes par la méthylation de leurs promoteurs a une grande
importance dans l’induction et la progression tumorale,
particulièrement de type MSI. Outre MLH1 déjà largement cité [8],
on peut signaler le cas du gène MGMT (O6-methylguanine-DNA
methyltransferase), codant pour une protéine dont le rôle est de
protéger la cellule des effets délétères des agents alkylant la
position O6 des guanines. Certaines modifications physiologiques
telles que l’inflammation, ou des drogues couramment utilisées en
clinique favorisent ce phénomène. Il a été montré que la perte
d’expression de la MGMT par la méthylation de son promoteur
n’empêchait plus les transitions G vers A dans la cellule,
favorisant les mutations de l’oncogène KRAS [55].
Signature moléculaire du phénotype MSI
Les techniques de criblage du génome à haute densité, comme le sont
les puces à ADN, permettent l’analyse rapide d’un grand nombre de
données d’expression de gènes. Ces techniques donnent la
possibilité d’attacher à des entités biologiques diverses une
signature moléculaire facilitant leur identification. L’analyse par
puces à ADN est de plus en plus utilisée dans le but d’établir des
profils spécifiques et de définir de nouveaux facteurs
pronostiques, notamment prédictifs de la réponse aux traitements
et/ou à visée diagnostique.
A ce jour, relativement peu de données ont été publiées
concernant l’étude du phénotype MSI par la technique de puces [56,
57]. La majorité des études est basée sur une comparaison de
cancers MSI versus MSS, plus rarement sur une analyse des profils
MSI comparés à ceux provenant de la muqueuse colique saine. Il
convient de regarder ces données avec recul, puisqu’elles ont été
souvent obtenues avec des puces d’expression de natures différentes
et hybridées en utilisant des protocoles différents. De plus, elles
ont été normalisées selon des méthodes différentes et analysées
avec des logiciels et des approches variables d’un laboratoire à
l’autre. La diversité des méthodes expérimentales et analytiques
utilisées jusqu’alors ne permet pas de réaliser une synthèse
homogène et cohérente de la masse de données de puces concernant
les cancers colorectaux humains. Néanmoins, il ressort de ces
études que la classification d’échantillons MSI versus normal ou
MSI versus MSS, en se basant sur les résultats d’analyse du
transcriptome, est relativement aisée. Il est à noter que les
différences observées peuvent ne pas résulter uniquement du
processus d’instabilité des microsatellites, mais aussi être dues
aux autres mécanismes oncogéniques associés au type MSI tels que
l’instabilité chromosomique modérée avec gain de chromosomes et la
méthylation d’un certain nombre de promoteurs.
Seule une vingtaine de gènes sont communs à au moins deux
articles (Mercier et al., analyse non publiée). On peut citer pour
exemple les gènes MGMT et MLH1, le récepteur de type 2 du TGFβ, un
gène cible classique de la carcinogenèse MSI, et la β-caténine. On
peut également remarquer des gènes marqueurs de l’infiltration
lymphocytaire ou immunomodulateurs, puisque les tumeurs MSI sont
classiquement décrites comme étant très immunogènes. La majorité de
ces gènes est associée à plusieurs voies de signalisation
clairement identifiées comme intervenant dans le processus de
tumorogenèse colorectale, comme les voies APC/β-caténine/TCF,
RAS/RAF/MAPK, p53 et TGFβ ou de l’apoptose pour ne citer que les
plus connues.
Autres localisations tumorales de type MSI
L’essentiel de ce qui est écrit dans cette revue concerne les
cancers colorectaux, mais peut également s’appliquer aux autres
localisations classiques du phénotype MSI telles que les cancers de
l’estomac et de l’endomètre. La différence principale est que les
tumeurs MSI de certaines de ces localisations peuvent avoir une
instabilité globale plus réduite en intensité (endomètre par
exemple) [13] et/ou un répertoire de gènes cibles d’instabilité
différent (endomètre à nouveau) [33, 34]. Nous n’insisterons pas
dans cette revue sur ces localisations, préférant présenter
d’autres tumeurs MSI moins fréquemment étudiées et dont la survenue
est associée à des contextes cliniques très particuliers. Le
spectre clinique des tumeurs MSI a effectivement pu être récemment
étendu, du fait notamment de travaux réalisés par notre groupe. Ces
travaux ont notamment permis de montrer que l’émergence de ces
tumeurs était favorisée chez des patients immunodéprimés et/ou
souffrant de pathologies inflammatoires chroniques. Ces faits
cliniques sont particulièrement d’intérêt lorsqu’on sait que la
carcinogenèse MSI est un processus de transformation
particulièrement immunogène et donc très contrôlé par l’immunité de
l’hôte (voir plus haut).
Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)
regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique
(RCH). On estime actuellement que 100 000 personnes en sont
atteintes en France (60 000 pour la MC, 40 000 pour la RCH). Les
MICI s’accompagnent d’une augmentation importante du risque de
survenue de cancers, en particulier colorectaux, avec, pour la
maladie de Crohn, un risque également augmenté de cancer de
l’intestin grêle. Le risque de survenue de cancers colorectaux au
cours des MICI augmente avec l’étendue des lésions et la durée
d’évolution de la maladie.
Ces cancers, qui dans leur très grande majorité sont des
adénocarcinomes, sont précédés, comme pour les cas sporadiques,
d’une lésion précancéreuse, la dysplasie (ou néoplasie
intra-épithéliale). Cependant, la pathogénie de la dysplasie et sa
signification d’un point de vue biologique, sont différentes dans
ces deux types de cancérogenèse : dans les cancers colorectaux
sporadiques, la lésion précurseur est le polype adénomateux, tandis
que, dans les MICI, la dysplasie peut être plane ou polypoïde et
est souvent multifocale. Les gènes altérés dans la carcinogenèse
colorectale associée aux MICI sont généralement les mêmes que ceux
décrits dans la carcinogenèse colorectale sporadique de type CIN,
mais avec des fréquences d’altérations différentes. C’est le cas en
particulier de KRAS. Certaines altérations sont de fréquence
comparable dans les deux types de cancer, mais apparaissent de
manière décalée au cours de la progression tumorale. C’est le cas
du gène p53, dont la mutation serait plus précoce dans la
carcinogenèse colorectale compliquant les MICI.
Le phénomène MSI semble également impliqué dans les cancers
intestinaux compliquant les MICI. Toutefois, il est décrit avec des
fréquences extrêmement variables, allant de moins de 1 % à
plus de 45 %. Les raisons principales pouvant expliquer de
telles variations d’une étude à l’autre sont, d’une part,
l’utilisation de marqueurs d’instabilité non sensibles et/ou non
spécifiques et, d’autre part, le faible nombre de cas étudiés,
puisqu’il s’agit de pathologies relativement rares. Dans une étude
récente menée par notre laboratoire sur une grande série de lésions
néoplasiques (277 lésions chez 205 malades), nous avons observé un
phénotype MSI dans 8,3 % des cas [58]. La fréquence de ce
phénotype est sensiblement la même dans la RCH (7,8 %) et dans
la MC (9,6 %). Le phénotype MSI est observé dès le stade de la
dysplasie, y compris la dysplasie de bas grade. Les mécanismes
d’induction de la tumorogenèse MSI dans les cancers colorectaux
survenant sur MICI semblent différents de ce qui est observé dans
les cancers MSI sporadiques du côlon. En effet, la méthylation du
promoteur de MLH1 est rarement observée, et l’immunohistochimie
indique que la déficience MMR de ces tumeurs est liée à des pertes
plus variées pouvant concerner MLH1, mais aussi MSH2, MSH6 ou
encore PMS2 [58]. Les mécanismes de progression tumorale semblent
toutefois identiques à ceux des autres tumeurs MSI (sporadiques et
héréditaires), notamment en termes de fréquence mutationnelle des
gènes cibles d’instabilité.
L’émergence d’un phénotype MSI dans les néoplasies intestinales
compliquant une MICI pourrait être en rapport avec l’inflammation
chronique et/ou la prise d’immunosuppresseurs, à l’instar de ce qui
a été suggéré dans les lymphomes du sujet immunodéprimé [59].
D’autres études semblent nécessaires pour faire toute la lumière
sur la survenue du phénotype MSI dans les néoplasies intestinales
compliquant les MICI.
Lymphomes de patients immunodéprimés
Les lymphomes non hodgkiniens correspondent à une prolifération du
tissu lymphoïde et regroupent un ensemble d’entités assez variables
sur le plan clinique, histologique, étiologique et pronostique. Ils
présentent cependant la caractéristique d’avoir une incidence
élevée chez les patients immunodéprimés dans un contexte de greffe
ou de sida. La réactivation du virus EBV a été proposée comme
mécanisme à l’origine de leur incidence accrue dans ces contextes,
mais il existe une proportion non négligeable de ces lymphomes qui
reste EBV-négatifs. En 2004, notre équipe a analysé une série de
603 lymphomes non hodgkiniens provenant de différents groupes
hospitaliers français et comprenant 239 prélèvements issus de
patients immunodéprimés et 364 prélèvements issus de patients
immunocompétents [59]. Cette étude a permis de trouver 12 cas
de lymphomes non hodgkiniens présentant un phénotype MSI
indiscutable et ce, uniquement chez des patients immunodéprimés. La
fréquence du type MSI a été estimée à 2,3 % chez les patients
atteints de sida et à 8,1 % chez les sujets greffés. Ces
résultats sont à rapprocher de ceux qui ont mis ultérieurement en
évidence un phénotype MSI dans des leucémies aiguës ou dans des
syndromes myélodysplasiques secondaires à des chimiothérapies
comportant des traitements immunosuppresseurs (Imurel) alors que ce
phénotype n’existe pas dans les formes primaires de ces tumeurs
[60]. Ils soulèvent la question du lien entre immunodépression et
instabilité des microsatellites.
Autres mécanismes dans lesquels le système MMR est
impliqué
La stabilité du génome est assurée grâce à l’existence de systèmes
multiples intervenant dans les processus de réplication, de
recombinaison et de réparation de l’ADN. Le système MMR, capital
pour la cellule, en est un exemple. En plus de leur rôle dans la
réparation des mésappariements, certaines protéines du système MMR
participent à la recombinaison, la réparation des cassures double
brin, l’apoptose et la régulation du cycle cellulaire. Les études
réalisées dans différents organismes ont montré que le système MMR
intervenait pour réguler la recombinaison entre séquences
homéologues, c’est-à-dire partiellement homologues [61], soit en
faisant avorter le processus de recombinaison entre des séquences
divergentes, soit en procédant à l’élimination des séquences non
appariées.
Plus indirectement, de nombreux gènes impliqués dans la
signalisation et la réparation des dommages de l’ADN sont des gènes
cibles d’instabilité fréquente dans les cancers MSI [62]. Ainsi,
pour le complexe MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) qui joue un rôle essentiel
dans la réparation des cassures double brin par recombinaison, le
gène MRE11 possède une répétition T11 intronique dont le
raccourcissement perturbe l’épissage [38, 62] et RAD50 possède une
répétition A9 codante fréquemment mutée par instabilité [35, 62].
Un autre exemple est celui de la DNA-PKcs, une kinase impliquée
dans la réparation des cassures double brin par recombinaison non
homologue pour laquelle un rôle a été formellement établi en
réponse à la bléomycine, et qui contient une répétition A10 codante
également cible d’instabilité [35, 62].
C’est probablement à cause de ces raisons multiples que les
tumeurs MSI montrent une sensibilité particulière (hypersensibilité
ou résistance) à certaines drogues, génotoxiques ou pouvant causer
des cassures double brin, utilisées en chimiothérapie, comme nous
l’avons rapporté ci-dessus.
Comment collecter les échantillons à analyser
Congélation
Toutes ces analyses nécessitent le développement de tumorothèques
constituées selon des règles bien établies. Un rapport récent
réalisé à la demande de l’Institut national du cancer (INCa)
définit l’intérêt et les recommandations pour constituer une
tumorothèque à visée sanitaire [63]. Une standardisation européenne
des procédures de cryoconservation pour les banques de tissus a été
récemment publiée [64]. La qualité du prélèvement congelé est
multifactorielle. Il s’agit tout d’abord d’établir une bonne
coordination entre les différents services hospitaliers. Idéalement
la pièce chirurgicale fraîche et non fixée doit arriver rapidement
après l’exérèse dans un récipient stérile déposé sur de la glace
pour limiter la dégradation des tissus. Le médecin procède à
l’examen macroscopique et prélève des échantillons tumoraux et
normaux en utilisant du matériel stérile ainsi que des cryotubes
annotés. Depuis l’exérèse jusqu’à la congélation, le délai doit
être minimal. Il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes
(temps moyen estimé où les changements de profil d’expression sont
d’environ 20 % par rapport à la normale). Si ce délai est
dépassé, la congélation n’est pas proscrite, mais il est nécessaire
de le notifier sur la base de données. Il est à noter l’existence
de milieux de transport qui facilitent la conservation des
prélèvements et empêchent notamment les RNases d’agir et de
dégrader les ARN au sein des tissus.
En matière de congélation, il semblerait que le protocole le
plus adéquat soit l’utilisation de l’isopentane refroidi dans
l’azote liquide. L’isopentane est un cryoconducteur très efficace
qui permet une congélation très rapide en causant moins de dommages
que l’azote liquide. Mais cette procédure comporte de nombreux
inconvénients (durée, complexité, équipement...). Si le tissu est
destiné à des analyses de biologie moléculaire, il est déconseillé
d’utiliser un cryoprotecteur qui pourtant préserve bien mieux
l’histologie du tissu et minimise la contamination biologique du
tissu. Le stockage des tissus congelés est optimal dans des cuves à
azote liquide ou dans des congélateurs – 80 °C à partir du
moment où ils sont couplés à un équipement de gestion des risques
(alarme locale, alarme distante).
Fixation
En matière de fixation des prélèvements anatomiques, il n’existe
pas réellement de fixateur optimal et unique. Suivant les analyses
qui seront faites par la suite (analyse histologique, coloration
spéciale, études immunohistochimiques, extraction d’ADN, analyses
de biologie moléculaire…), le fixateur idéal n’est pas le même.
Pour la coloration, la fixation en AFA (alcool-formol acétique) est
la meilleure, alors que pour l’immunohistochimie, la fixation
d’environ 24 heures (mais n’excédant pas 48 heures) en
formol convient le mieux. C’est également le cas pour l’extraction
d’acides nucléiques. Si on considère toutes les analyses possibles,
le fixateur qui pose le moins de problème est le formol 4 %
prédilué et tamponné à pH 7,2-7,4. Il faut absolument
proscrire le Bouin qui pose d’énormes problèmes pour les analyses
moléculaires des protéines et des acides nucléiques.
Conclusion
L’importance de la détermination du statut MSI des tumeurs (ou de
certaines tumeurs) n’est plus mise en doute pour aider à
reconnaître les patients des familles HNPCC. L’impact clinique du
phénotype MSI sur la réponse à la chimiothérapie des patients
atteints de cancer colorectal a été démontré dans des études
récentes, comme cela a été rapporté ici et dans une revue plus
complète sur le sujet [65]. Mais avant que les recommandations de
traitement des patients ne soient adaptées en fonction du statut
MSI, d’autres études cliniques impliquant de plus grandes cohortes,
randomisées et prospectives sont indispensables pour valider les
premières observations. On peut également anticiper qu’une
meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés
directement, ou indirectement, au défaut du système MMR
caractéristique des tumeurs MSI, permettra de développer de
nouvelles approches thérapeutiques pour cibler directement ce type
tumoral.
Remerciements
Nous tenons également à remercier Madame Evelyne Thai,
secrétaire-gestionnaire, et Madame Marie-Annick Marry, aide
technique de l’unité Inserm U762, Instabilité des Microsatellites
et Cancers. Et bienvenue aux nouveaux entrants dans le monde
MSI : Coralie Dorard, Illiasse Massaoudi, Yan Ansquer et
François Radais.
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