Impact de la congélation sur la stabilité des collyres de péfloxacine à 40 mg/ml

ARTICLE

Le traitement d'infections ophtalmiques sévères (ulcères de cornée, endophtalmies) nécessite l'utilisation de collyres antibiotiques de concentration élevée, non commercialisés [6]. Ces collyres dits « fortifiés » peuvent être prescrits dans des infections oculaires à germe sensible, après isolement et antibiogramme. La pharmacie du CHU de Clermont-Ferrand est souvent amenée à réaliser ces préparations principalement à base de péfloxacine à 40 mg/ml. La péfloxacine, quinolone de deuxième génération, présente les avantages d'une bactéricidie rapide, d'un spectre large, d'une pénétration intracornéenne et de l'absence de résistance croisée avec les autres antibiotiques. L'utilisation d'une quinolone est particulièrement intéressante en monothérapie dans les ulcères cornéens [1]. Les collyres sont administrés à la posologie suivante : 1 goutte dans le cul-de-sac conjonctival inférieur, en instillations fréquentes au début du traitement (toutes les heures, voire toutes les 15 à 30 minutes si l'infection cornéenne est sévère), puis 4 à 6 fois par jour pendant 6 à 7 jours environ. Le traitement ne dépasse pas 10 jours [5].

Face à la prescription croissante de ces collyres de péfloxacine à 40 mg/ml, le laboratoire de contrôle-développement de la pharmacie a étudié leur stabilité afin d'envisager leur préparation à l'avance et de permettre ainsi une mise à disposition immédiate en situation d'urgence ophtalmique. Une étude préliminaire a mis en évidence la conservation possible des collyres de péfloxacine à 40 mg/ml pendant 8 jours au réfrigérateur [4]. L'objectif de notre travail consiste à évaluer l'impact d'une congélation suivie d'une décongélation puis d'une réfrigération de 48 h de cette préparation. Dans ce but, nous avons étudié d'une part la stabilité physico-chimique de la solution médicamenteuse et d'autre part la conservation de l'état stérile des collyres.

Matériels et méthodes

Préparation des collyres

La préparation des collyres est effectuée sous hotte à flux d'air laminaire. Pour la réalisation d'une série de 12 collyres, le matériel comprend :

- 2 ampoules de péflacine injectable de 5 ml à 400 mg (Laboratoires Bellon),

- 1 ampoule de 10 ml de glucose 5 % solution injectable isotonique (Laboratoires Aguettant),

- 1 seringue de 30 ml (Omnifix, Laboratoire Braun) munie d'une aiguille (Microlance 3, Laboratoire Becton-Dickinson),

- 1 filtre Minisart 16534 K de porosité 0,22 µm (Laboratoires Sartorius),

- 12 flacons en verre coloré de 5 ml préalablement stérilisés par la vapeur (20 minutes à 120 °C) et contrôlés.

La solution de péfloxacine à 40 mg/ml est obtenue par mélange de 2 ampoules de péfloxacine à 400 mg/5 ml dans 10 ml de solution de glucose 5 %. Les 20 ml de solution sont répartis équitablement, après filtration stérilisante sur filtre 0,22 µm, dans les 12 flacons de 5 ml qui seront soigneusement obturés par un bouchon de caoutchouc et sertis d'une capsule d'aluminium. La solution de glucose 5 % a été choisie comme solvant de dilution car elle permet l'obtention d'un collyre de péfloxacine à 40 mg/ml présentant un pH et une osmolalité compatible avec une administration intra-oculaire. L'intégrité du conditionnement est vérifié visuellement et par retournement du flacon obturé et serti.

Méthodologie de l'étude de stabilité

L'étude de stabilité a été réalisée sur trois séries de 12 collyres de péfloxacine à 40 mg/ml préparées chacune à une semaine d'intervalle. Pour chaque série, la méthodologie est la suivante : immédiatement après la fabrication (J0), un des 12 collyres est analysé (les résultats obtenus serviront de référence). Un deuxième collyre est placé au réfrigérateur et est analysé à J2, c'est-à-dire après 48 h de réfrigération. Les 10 autres collyres son congelés à - 20 ± 2 °C : ils sont sortis du réfrigérateur deux à deux après 7, 14, 30 et 90 jours de conservation. Pour chaque couple de collyres, l'un est analysé immédiatement après décongélation, le second est placé au réfrigérateur pendant 48 heures avant analyse. Le schéma d'organisation de l'étude est présenté dans le tableau I. Ce délai de stabilité de 48 h au réfrigérateur après décongélation est fonction de l'utilisation clinique des collyres fortifiés (pour couvrir un week-end).

De façon générale, un collyre doit être stérile, isotonique aux larmes, exempt de particules traumatisantes (limpide), avoir un pH voisin de la neutralité et non irritant [3]. Par conséquent l'analyse de chaque collyre consiste en :

- une analyse bactériologique permettant de vérifier sa stérilité,

- une analyse physico-chimique comprenant les essais suivants : une évaluation de la limpidité de la solution, une détermination du pH, de l'osmolalité. Un dosage quantitatif de la péfloxacine est également mis en œuvre.

La méthodologie de ces divers essais est développée ci-après.

Analyse bactériologique

Elle consiste à filtrer le collyre sur une membrane, puis à ensemencer cette membrane sur un milieu de culture solide. La filtration est réalisée à l'aide de kits à usage unique (Nalgene Analytical Test Filter Funnel, 0,45 µm, 100 ml, Brand Products) : 1 ml de collyre est filtré sur la membrane du kit, puis un rinçage à l'aide de 3 fois 50 ml d'eau stérile est effectué afin d'inhiber l'action antibiotique du produit et de permettre une croissance bactérienne éventuelle. La membrane est ensemencée sur une gélose trypcase-soja (Laboratoires Biomérieux), puis incubée à 30-35 °C pendant 48 h. Le dénombrement des germes se fait alors sous lampe binoculaire. En cas de croissance bactérienne, les germes seront identifiés.

Analyse physicochimique

Le contrôle optique est un examen visuel des collyres réalisé à l'œil nu sur fond blanc puis sur fond blanc sous éclairage à l'aide d'une mireuse (type LR 28 PW Allen and Co). Ce contrôle permet de vérifier la limpidité des collyres conformément à la pharmacopée européenne [3].

Le pH des solutions est mesuré à l'aide de bandelettes réactives indicatrices de pH (gamme de pH de 2,5 à 4,5, Laboratoires Merck).

L'osmolalité est effectuée à l'aide d'un biocryomètre à partir d'un échantillon de 20 µl de collyre.

Le dosage de la péfloxacine est réalisé par chromatographie liquide haute performance d'après les travaux de Chang et al. [2]. L'analyse est effectuée à l'aide de l'appareillage suivant (Merck-Hitachi) : pompe à débit constant (655A-11 pump), système d'injection (modèle 7125 Rheodyne injection loop), détecteur UV-Visible (LCM variable wavelenght detector), intégrateur (D2500 chromato-integrator). La colonne d'analyse est une colonne Lichrospher RP-18, 125 x 4 mm ID, 5 µm (Macherey-Nagel). La phase mobile consiste en un mélange d'acétonitrile et d'acide citrique 0,4 M dans les proportions de 20/100 vol/vol. Le débit est de 1 ml/min. La longueur d'onde est fixée à 280 nm. Les solutions standard sont préparées par dilution de la solution de péfloxacine à 80 mg/ml dans la phase mobile afin d'obtenir des concentrations de 20, 40 et 60 µg/ml. La technique d'analyse mise en œuvre a été validée dans l'objectif d'une étude de stabilité selon les recommandations formulées par L.A. Trissel pour la stabilité des solutions injectables [7]. Elle permet d'analyser de façon spécifique la péfloxacine et de mettre en évidence ses produits de dégradation éventuels. Dans cet objectif, nous avons effectué une dégradation intentionnelle de la péfloxacine en faisant varier le pH de la solution avec NaOH 5N, puis en réalisant un chauffage intense (ébullition pendant 5 min). La solution obtenue a été analysée par chromatographie pour s'assurer de l'absence d'interférences avec les produits de dégradation générés.

Les concentrations moyennes de péfloxacine obtenues aux différents temps de prélèvement sont calculées à partir de trois séries de collyres. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la concentration initiale obtenue à J0 (immédiatement après la préparation, valeur considérée comme référence et égale à 100 %). La stabilité de la molécule médicamenteuse est considérée comme correcte si sa concentration ne diminue pas de plus de 10 % par rapport à la concentration initiale [8].

Résultats et discussion

Analyse bactériologique

Après 3 mois de conservation au congélateur à - 20 ± 2 °C, la stérilité des collyres est maintenue. Il en est de même après une réfrigération de 48 h suite à la congélation. Les flacons doivent être hermétiquement clos : il convient de vérifier l'intégrité du conditionnement avant stockage des collyres.

Contrôle optique

Le mirage des collyres n'a mis en évidence aucune particule durant les 3 mois de congélation suivis de 48 h de réfrigération.

pH

Nous n'avons constaté aucune variation de pH des collyres de péfloxacine dans le temps. Celui-ci est stable à 4,2 et cette valeur est cohérente avec une administration intraoculaire de la solution. En effet, le film lacrymal forme un système tampon à pH 7,4, capable de ramener rapidement à une valeur de pH tolérable (entre 6,4 et 9,6) des solutions de pH entre 3,5 et 10,5 à condition que leur propre capacité tampon soit faible [5].

Osmolalité

L'évolution de l'osmolalité au cours de l'étude est présentée sur la figure 1. Après congélation et réfrigération, l'osmolalité ne varie pas de plus de 5 % par rapport à la valeur moyenne mesurée immédiatement après préparation des collyres (soit 284,5 ± 1,1 mOsm/kg). Les valeurs d'osmolalité obtenues sont compatibles avec une administration intra-oculaire de la solution de péfloxacine à 40 mg/ml.

Analyse de la péfloxacine

La méthode de dosage de la péfloxacine a été validée. La précision (répétabilité et reproductibilité) est satisfaisante avec des coefficients de variation inférieurs à 5 % (tableau II). La linéarité de la méthode est bonne pour des concentrations en péfloxacine de 20 à 60 µg/ml : le coefficient de corrélation est de 0,9998 (r² = 0,9996). L'équation de la droite moyenne de calibration est y = 174195 x + 260807. La méthode mise en œuvre permet d'analyser la péfloxacine de façon spécifique et indépendamment de ses produits de dégradation éventuels. L'analyse chromatographique montre que les produits de dégradation n'interfèrent pas avec la réponse de la molécule initiale.

Les résultats sont exposés dans le tableau III. Nous n'observons pas de variation de la concentration en péfloxacine de plus de 5 % par rapport à la valeur initiale à J0 (immédiatement après préparation des collyres) durant les 3 mois de congélation. De même, la décongélation des collyres suivie d'une réfrigération de 48 h n'entraîne aucune diminution significative de la concentration en péfloxacine. Aucun produit de dégradation n'a été mis en évidence sur l'ensemble des prélèvements analysés par chromatographie liquide haute performance.

Ces différentes analyses physicochimiques et bactériologiques mettent en évidence une bonne stabilité des collyres de péfloxacine à 40 mg/ml durant 3 mois de congélation à - 20 ± 2 °C. Suite à cette congélation, ces collyres peuvent être conservés pendant 48 heures au réfrigérateur. Ces modalités de conservation (particulièrement au congélateur pendant plusieurs mois) présentent de nombreux avantages :

- il est possible de réaliser un stock de préparation, ce qui permet de dispenser plus rapidement les collyres aux patients que lors d'une préparation extemporanée consécutive à une prescription nominative ;

- les collyres sont préparés à l'avance, en série, et bénéficient donc d'un contrôle physicochimique et bactériologique avant administration au malade, ce qui permet une amélioration de la qualité par rapport à une préparation extemporanée (dans ce cas un contrôle physicochimique est envisageable mais les résultats des contrôles bactériologiques ne peuvent pas être obtenus puisqu'ils nécessitent un délai d'incubation de 48 h) ;

- par rapport à une précédente étude ayant mis en évidence une bonne stabilité des collyres pendant 8 jours au réfrigérateur, ces conditions de conservation pendant 3 mois au congélateur permettent une meilleure gestion de la production.

CONCLUSION

REFERENCES

1. Bron A, Delbosc B, Kaya G, Talon D, Estavoyer JM, Montard M. Intérêt des nouvelles quinolones en ophtalmologie. Ophtalmologie 1988 ; 2 : 107-9.

2. Chan CY, Lam AW, French GL. Rapid HPLC assay of fluoroquinolones in clinical specimens. J Antimicrobial Chemother 1989 ; 23 : 597-604.

3. Pharmacopée européenne. Conseil de l'Europe Strasbourg 1997, 3^e édition.

4. Pichot S, Sautou-Miranda V, Arvouet A, et al. Communication affichée, 13^es journées nationales d'information des pharmaciens hospitaliers, Antibes-Juan-les-Pins, 1997.

5. Sauvageon-Martre H, Bonneau I, Fayet B, Chast F et comité de rédaction. Produits en ophtalmologie. Dossier du CNIMH 1993 ; XIV : 2-3.

6. Steinert RF. Current therapy for bacterial keratitis and bacterial conjunctivis. Am J Ophthalmol 1991 ; 98 : 847-53.

7. Trissel LA. Avoiding common flows in stability and compatibility studies of injectable drugs. Am J Hosp Pharm 1983 ; 40 : 1159-60.

8. Trissel LA. Handbook on injectable drugs. 8th ed. Bethesda, American Society of Hospital Pharmacists, 1994.