ARTICLE
Auteur(s) : Abdellah
Zinedine1, Carlo
Brera2, Mohamed Faid3, Mohamed
Benlemlih4, Marina
Miraglia2
1Laboratoire de toxicologie alimentaire, Institut
national d’hygiène, 27, avenue Ibn Batouta, BP 769 Agdal, Rabat
Maroc
2Reparto chimica dei cereali, Laboratorio alimenti,
Instituto superiore di sanità, Viale Regina Elena, 299, 00161 Rome
Italie
3Département de microbiologie et biotechnologie
alimentaire, Institut agronomique et vétérinaire Hassan II, BP 6202
Rabat-Instituts, Maroc
4Laboratoire de microbiologie de l’environnement,
Faculté des Sciences Dhar El Mahrèz, BP 1796, Fès Maroc
Les mycotoxines sont des contaminants naturels de
l’alimentation humaine et animale ; elles sont produites par
les moisissures des genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium. En
raison de leur stabilité thermique, ces substances constituent un
danger potentiel chez l’homme et les animaux. Actuellement, plus de
300 mycotoxines sont identifiées dans le monde, mais seules
quelques-unes d’entre elles attirent l’attention des chercheurs. Ce
sont les aflatoxines, l’ochratoxine A (OTA), la fumonisine
B1 (FB1), la zéaralénone (ZEN) et les
trichothécènes (déoxynivalénol, toxines T2 et HT2). Les propriétés
chimiques et biologiques des mycotoxines sont diverses et leurs
effets toxiques sont extrêmement variables. Ces effets concernent
en général la carcinogénécité, la génotoxicité, la tératogénicité,
la néphrotoxicité, l’hépatotoxicité et l’immunotoxicité (Galvano
et al., 2001 ; Creppy 2002). Les mycotoxines sont des
métabolites capables de provoquer chez l’homme des syndromes
spécifiques. En effet, d’après les monographies de l’Agence
internationale de recherche sur le cancer (International Agency for
Research on Cancer, IARC), l’aflatoxine B1 (AFB1) est la substance
la plus cancérigène parmi les substances d’origine naturelle (IARC,
1993). L’OTA pourrait être impliquée dans les néphropathies
endémiques des Balkans (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002). La ZEN
est une mycotoxine produite par les espèces de Fusarium ; ses
métabolites ont montré une compétitivité avec les récepteurs
œstrogènes, elle est classée dans le groupe 3 par l’IARC (IARC,
1999), alors que la FB1 pourrait être associée au cancer
de l’œsophage chez l’homme (Norred et Voss, 1994). Non seulement
les mycotoxines sont dangereuses pour la santé du consommateur,
mais elles altèrent aussi la qualité marchande des produits
contaminés entraînant ainsi de fortes pertes économiques.Au Maroc,
les céréales occupent une importance sociale, économique et
nutritionnelle pour la population. En raison des périodes de
sécheresse qu’a connues le Maroc ces deux dernières décennies, la
production céréalière a enregistré une diminution de 25 à
85 %, entraînant un approvisionnement auprès de pays tiers
pour satisfaire le marché national. Actuellement, on estime
qu’environ 25 % des céréales produites à l’échelle
internationale sont contaminées par des mycotoxines (Davegowda
et al., 1998).Le Maroc est un pays méditerranéen caractérisé
par un climat chaud et humide favorisant la croissance des
moisissures dans les zones côtières qui abritent environ 70 %
de la population totale. D’après Lafont (1970), les premières
observations relevées dès 1945 à l’Institut national d’hygiène du
Maroc, ont signalé une intoxication de porcs par une alimentation
moisie. Peu de travaux ont été entrepris pour rapporter la
contamination des denrées alimentaires par les champignons
toxinogènes. Les études préliminaires ont montré que certains
produits agricoles marocains étaient contaminés par l’AFB1 et l’OTA
(Tantaoui-Elaraki et al., 1994 ; Filali et al.,
2001 ; Kichou et Wasler, 1993). Cependant, il n’y a pas
suffisamment d’informations sur l’occurrence naturelle des toxines
de Fusarium dans les céréales, notamment la FB1 et la
ZEN. Le présent travail a pour but de déterminer la présence de ces
mycotoxines dans des céréales commercialisées au Maroc.
Matériel et méthode
Échantillonnage
Soixante échantillons de céréales commercialisées au Maroc, dont le
blé (n = 20), l’orge (n = 20) et le maîs (n = 20), ont été prélevés
sur les points de vente des villes de Rabat et Salé. Tous ces
échantillons ont été transportés à l’unité d’analyse des
mycotoxines du Laboratorio Alimenti de l’Instituto Superiore di
Sanità de Rome (Italie) pour déterminer la présence de l’OTA, de la
ZEN et de la FB1.
Standards de mycotoxines
La préparation des standards de mycotoxines a été effectuée selon
les procédures internationales officielles. Les mycotoxines sont
des substances potentiellement toxiques pour l’homme, ce qui
implique que leur manipulation doit être effectuée dans un
laboratoire spécialisé, équipé du matériel de protection adéquat
(gants, hottes d’aspiration, masques…).
Analyse des mycotoxines
Analyse de l’OTA
Les échantillons ont été analysés suivant une méthode validée et
rapportés par Yazdanpanah et al. (2001) avec quelques
modifications. Un échantillon de 25 g a été soumis à une
extraction par 100 mL de mélange eau-acétonitrile (60:40, v/v)
en utilisant un blinder pendant 3 minutes ; on a ensuite
effectué une filtration sur papier-filtre Whatman n° 4. De ce
filtrat, 4 mL ont été dilués par 44 mL d’une solution de
tampon phosphate (PBS, pH 7,3). puis 46 mL du filtrat
dilué ont été appliqués à une colonne d’immunoaffinité
(Ochraprep®, R-Biopharm Rhône LTD, Glasgow, UK). La
colonne a été lavée par 10 mL d’eau bidistillée et l’air a été
chassé par aspiration. L’OTA a été éluée par application de
1,5 mL de méthanol (2 %) acidifié par l’acide acétique
glacial. L’éluat a été dilué avec 1,5 mL d’eau bidistillée et
mélangé au vortex. Un prélèvement de 200 μL de l’éluat dilué a
été injecté à un chromatographe CLHP1
équipé d’un injecteur automatique, d’une colonne C18 Kromasil KR100
(150 x 4,6 mm, 5 μm) et d’un détecteur de fluorescence.
La phase mobile utilisée était le mélange acétonitrile-eau
(2 %) acidifié par l’acide acétique glacial (50:50, v/v), le
débit étant fixé à 1 mL/min. Le fluorimètre opérait à des
longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 333 et 460 nm,
respectivement.
Analyse de la ZEN
Les échantillons ont été analysés suivant une méthode validée au
laboratoire. Vingt-cinq grammes d’échantillon broyés ont été
extraits par 125 mL d’acétonitrile à 75 % dans l’eau
bidistillée en utilisant un blinder à grande vitesse pendant
2 minutes. Après filtration sur papier Whatman n° 4,
20 mL du filtrat ont été dilués par 80 mL d’eau
bidistillée. Puis 25 mL du filtrat dilué ont été appliqués à
une colonne d’immunoaffinité (Easi-Extract® Zéaralenone,
R-Biopharm Rhône LTD, Glasgow, UK). Après lavage de la colonne par
10 mL d’eau bidistillée et élimination de l’air par
aspiration, la ZEN a été éluée par application de 1,5 mL de
méthanol. L’éluat a été dilué avec 1,5 mL d’eau bidistillée et
mélangé au vortex. Enfin, 100 μL de l’éluat dilué ont été
injectés à un chromatographe CLHP (même équipement que dans l’OTA).
La phase mobile utilisée était le mélange acétonitrile-eau-méthanol
(46:46:8 v/v/v) à un débit de 1 mL/min, le fluorimètre opérant
à des longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 274 et
440 nm, respectivement.
Analyse de la FB1
L’extraction de la FB1 a été réalisée selon la méthode AOAC décrite
par Visconti et al. (2001). Vingt-cinq grammes d’échantillon
broyés ont été extraits par un mélange méthanol-acétonitrile-eau
(25:25:50, v/v/v) en utilisant un blinder pendant 4 minutes.
Après filtration sur papier Whatman n° 4, 10 mL du
filtrat ont été dilués avec 40 mL du PBS. Une colonne
d’immunoaffinité (Fumoniprep, R-Biopharm Rhône LTD, Glasgow, UK) a
été conditionnée par 5 mL du PBS. Dix millilitres du filtrat
dilué ont été appliqués à la colonne. La colonne a été lavée par
10 mL d’eau bidistillée et l’air chassé par aspiration. La ZEN
a été éluée par application de 1,5 mL de méthanol. L’éluat
dilué avec 1,5 mL d’eau bidistillée a été ensuite homogénéisé
au vortex. La dérivatisation précolonne des extraits a été
effectuée avec le mélange Ortho-Phtaldialdéhyde
(OPA)/2-mercaptoéthanol (MCE). Le réactif OPA/MCE était préparé
chaque semaine en dissolvant 120 mg d’OPA dans 3 mL de
méthanol auquel 15 ml de tétraborate de sodium (0,1M) et
150 mL de MCE étaient ajoutés. Le réactif étant photosensible,
il devait être conservé à l’abri de la lumière. Puis 450 μL du
réactif OPA/MCE étaient mélangés avec 50 μL de l’extrait à
analyser et homogénéisés au vortex. Après 3 minutes,
100 μL étaient injectés à un chromatographe CLHP comportant un
injecteur automatique, une colonne C18 (150 x 4 mm,
5 μm) et un détecteur de fluorescence. La phase mobile
utilisée était le mélange méthanol-dihydrogénophosphate de sodium à
0,1M (77:23, v/v) ajusté à un pH 3,35 avec 85 % d’acide
phosphorique. Le débit était fixé à 1 mL/min, alors que le
fluorimètre opérait à des longueurs d’ondes d’excitation et
d’émission de 335 et 440 nm, respectivement.
Contrôle qualité
Pour chaque série d’analyses, des échantillons de céréales ont été
fortifiés par des ajouts connus de mycotoxines. Après
homogénéisation des échantillons, le solvant était mis à évaporer
pendant la nuit. Les échantillons fortifiés ont été analysés avec
chaque série d’analyse pour déterminer le pourcentage de
recouvrement pour chaque mycotoxine et chaque matrice à analyser.
Tous les résultats analytiques ont été corrigés en fonction des
pourcentages de recouvrement (Rc) obtenus.
Résultats et discussion
Performance des méthodes analytiques
Les analyses statistiques des performances des méthodes analytiques
utilisées pour la détermination des mycotoxines dans les céréales
sont représentées dans le tableau 1( Tableau 1 ). Les pourcentages de recouvrement (Rc)
pour l’OTA, la ZEN et la FB1 dans les céréales étaient bons et se
situaient dans les limites acceptables à l’échelle internationale
(70-120 %). Le coefficient de variation pour la
reproductibilité des échantillons fortifiés par les mycotoxines
variait entre 1,52 et 24,28 %.
Tableau 1 Analyse statistique de quelques performances
des méthodes analytiques de l’OTA, la ZEN et la FB1 dans
les céréales.Table 1. Statistical analysis of some performances of
analytical methods of OTA, ZEN and FB1 in cereals.
|
Céréales
|
Mycotoxine
|
Taux de fortification
|
Rc (%)a
|
SDb
|
CV (%)c
|
|
Orge
|
OTA
|
0,11 μg/kg
|
96,56
|
0,005
|
4,50
|
|
|
0,22 μg/kg
|
101,7
|
0,032
|
15,78
|
|
|
0,12 μg/kg
|
94,16
|
0,021
|
17,8
|
|
ARRAY(0x23a60c)
|
|
Maïs
|
OTA
|
0,25 μg/kg
|
87,5
|
0,01
|
3,41
|
|
|
0,7 μg/kg
|
98,14
|
0,125
|
16,6
|
|
|
0,27 μg/kg
|
83,7
|
0,025
|
11,3
|
|
|
0,1 μg/kg
|
82,3
|
0,011
|
9,10
|
|
ARRAY(0x23df20)
|
|
Blé
|
OTA
|
0,16 μg/kg
|
85,5
|
0,013
|
9,28
|
|
|
1,7 μg/kg
|
92,3
|
0,04
|
2,66
|
|
|
0,8 μg/kg
|
94,4
|
0,012
|
1,52
|
|
ARRAY(0x240570)
|
|
Maïs
|
ZEN
|
25 μg/kg
|
116,12
|
6,04
|
24,28
|
|
|
50 μg/kg
|
93,66
|
1,45
|
2,9
|
|
|
10 μg/kg
|
92,3
|
0,88
|
9,73
|
|
ARRAY(0x241fa4)
|
|
Maïs
|
FB1
|
0,78 mg/kg
|
80,35
|
0,035
|
4,33
|
|
|
0,93 mg/kg
|
82,5
|
0,075
|
8,3
|
aPourcentage de recouvrement.
bécart type.
cCoefficient de variation pour la
reproductibilité.
Présence de mycotoxines dans les céréales
Les résultats de la contamination des céréales par les mycotoxines
sont représentés dans les tableaux 2 et 3( Tableau 2 )( Tableau 3
). Ainsi, 40, 40 et 55 % respectivement des échantillons de
maïs, de blé et d’orge analysés sont contaminés par l’OTA. Dans les
échantillons d’orge, les niveaux d’OTA varient entre 0,04 et
0,8 μg/kg, avec une concentration moyenne de l’ordre de
0,17 μg/kg. Dans les échantillons de blé, la concentration
d’OTA varie entre 0,04 et 1,73 μg/kg, avec une concentration
moyenne de l’ordre de 0,09 μg/kg (tableau 3). Dans les
échantillons de blé et d’orge, la ZEN et la FB1 étaient
au-dessous de la limite de détection de ces toxines.
En ce qui concerne le maïs, la concentration moyenne en OTA est
d’environ 0,43 μg/kg, alors que la valeur la plus élevée a été
enregistrée dans l’échantillon n° 3 (7,22 μg/kg). Cette
dernière valeur dépasse la limite maximale fixée par la
réglementation européenne concernant l’OTA dans les céréales et qui
est établie à 5 μg/kg (Creppy, 2002).
Concernant la co-occurrence naturelle des toxines de Fusarium
avec l’OTA parmi les céréales analysées, 15 et 50 % des
échantillons de maïs contaminés par l’OTA se trouvent aussi
contaminés par la ZEN et la FB1. Les concentrations en
ZEN varient entre et 11,8 et 16,5 μg/kg alors que les
concentrations en FB1 se situent entre 0,01 et
5,96 mg/kg. Les valeurs moyennes des concentrations de la ZEN
et la FB1 sont respectivement de 2,09 μg/kg et
0,96 mg/kg. Tous les échantillons de maïs contaminés par l’OTA
étaient contaminés par une autre mycotoxine (ZEN ou
FB1). Un seul échantillon (n° 7) a été trouvé
contaminé simultanément par les trois mycotoxines avec des
concentrations respectives de 13,5 μg/kg de ZEN,
0,05 μg/kg d’OTA et 1,51 mg/kg de FB1.
La concentration la plus élevée en FB1 a été
enregistrée au niveau de l’échantillon de maïs n° 3
(5,96 mg/kg). Cette valeur dépasse largement la valeur
susceptible d’être retenue par la réglementation européenne pour le
maïs et les produits à base de maïs, et qui serait de l’ordre de
2 mg/kg. Une concentration élevée, de l’ordre de
5,5 mg/kg en FB1, a été retrouvée dans
l’échantillon n° 10 ; cependant le taux d’OTA dans cet
échantillon demeure faible (0,11 μg/kg). Ces résultats
suggèrent que la co-occurrence de l’OTA et de la FB1
dans les échantillons de maïs analysés est probablement due à deux
processus de contaminations séparées par les moisissures
toxinogènes du champ (Fusarium) et de stockage (Aspergillus). Le
maïs est considéré comme une céréale à risque élevé de
contamination par les moisissures toxinogènes, à la différence
d’autres céréales susceptibles d’être plus résistantes à la
contamination par les moisissures, comme l’orge et le blé (Jelinnek
et al., 1989). Les résultats concordent avec les travaux
effectués sur l’OTA, notamment ceux de Maaroufi et al. (1995),
Miraglia et al. (1995) et Beretta et al. (2002) qui ont
trouvé que les céréales et les produits dérivés originaires des
pays de la région méditerranéenne pouvaient être contaminés par
l’OTA en raison du climat caractérisé par une chaleur humide et des
températures élevées.
Tableau 2 Co-occurrence naturelle de l’OTA, de la FB1
et la ZEN dans les échantillons du maïs.Table 2. Natural
co-occurrence of OTA, FB1 and ZEN in corn samples.
|
Échantillons de maïs (n = 20)
|
OTA (μg/kg)
|
FB1 (mg/kg)
|
ZEN (μg/kg)
|
|
1
|
-
|
1,15
|
16,50
|
|
2
|
-
|
1,00
|
11,8
|
|
3
|
7,22
|
5,96
|
-
|
|
4
|
0,1
|
2,61
|
-
|
|
5
|
0,28
|
0,28
|
-
|
|
6
|
0,54
|
0,01
|
-
|
|
7
|
0,05
|
1,51
|
13,5
|
|
8
|
0,27
|
0,60
|
-
|
|
9
|
0,05
|
0,70
|
-
|
|
10
|
0,11
|
5,50
|
-
|
|
ARRAY(0x24dc98)
|
|
Moyenne (μg/kg)
|
0,43
|
0,96
|
2,09
|
|
Échantillons positifs (%)
|
40
|
50
|
15
|
Tableau 3 L’OTA dans les échantillons de blé et de
l’orge.Table 3. OTA in wheat and barley samples.
|
Céréales
|
OTA (μg/kg)
|
|
Orge (n = 20)
|
|
|
1
|
0,10
|
|
2
|
0,18
|
|
3
|
0,13
|
|
4
|
0,20
|
|
5
|
0,05
|
|
6
|
0,12
|
|
7
|
0,05
|
|
8
|
0,12
|
|
9
|
0,80
|
|
10
|
0,05
|
|
11
|
0,04
|
|
ARRAY(0x251ef0)
|
|
|
Moyenne (μg/kg)
|
0,09
|
|
Échantillons positifs (%)
|
55
|
|
ARRAY(0x253250)
|
|
Blé (n = 20)
|
|
|
1
|
0,86
|
|
2
|
0,16
|
|
3
|
0,10
|
|
4
|
1,73
|
|
5
|
0,04
|
|
6
|
0,36
|
|
7
|
0,05
|
|
8
|
0,06
|
|
ARRAY(0x254e48)
|
|
Moyenne (μg/kg)
|
0,17
|
|
Échantillons positifs (%)
|
40
|
Conclusion
Ce travail a montré la possibilité de contamination des céréales
commercialisées au Maroc par les mycotoxines et la co-occurrence
naturelle de l’OTA avec des toxines élaborées par Fusarium (la ZEN
et la FB1), notamment dans le maïs. Il serait
intéressant de conduire d’autres études en élargissant la gamme des
produits afin d’établir un bilan des connaissances actuelles et de
comprendre le processus de mycotoxinogenèse. Il est aussi
nécessaire d’étudier l’impact de ces toxines sur la population
marocaine et de protéger le consommateur local des problèmes
chroniques éventuels posés par ces toxines, en raison de
l’élaboration d’un projet de réglementation de ces toxines dans les
produits agricoles au Maroc et par l’instauration d’un programme de
contrôle et de surveillance à l’échelle nationale.
Remerciements
Ce travail a été réalisé dans le cadre du Programme de coopération
technique et scientifique entre le Maroc et l’Italie (2003). Les
auteurs remercient le ministère des Affaires étrangères italien
pour sa contribution à la réalisation de cette étude.
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|
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