Le foie bioartificiel interne

ARTICLE

La transplantation hépatique est actuellement le traitement reconnu d'un certain nombre d'hépatopathies sévères, et notamment des hépatites fulminantes. La plupart des équipes font état d'un taux de survie supérieur à 70 % à 1 an [1, 2], mais la greffe hépatique reste une intervention lourde, en particulier chez les sujets fragiles. Elle nécessite une immunosuppression à vie, son coût est élevé, et elle se heurte à un manque important de donneurs. De ce fait, certains malades meurent ou développent des séquelles neurologiques irréversibles en attendant un donneur, plus particulièrement en cas d'hépatite fulminante [3]. A côté des méthodes visant à optimiser le rendement de la transplantation, telles que le partage des organes, la transplantation d'un foie auxiliaire [4] et les donneurs vivants, des alternatives doivent être trouvées. Parmi celles-ci, le foie bioartificiel, encore expérimental, utilisant des hépatocytes isolés peut être conçu soit comme un bioréacteur extracorporel [5, 6] sur lequel est branché le malade pendant la période aiguë de l'attente d'un greffon, soit comme un foie bioartificiel interne (FBAI]. Ce dernier a l'avantage d'une plus grande simplicité. De plus, il laisse le foie du receveur en place, et donc ne compromet pas une éventuelle régénération du foie receveur ou une transplantation hépatique ultérieure.

Principe du foie bioartificiel interne

Le but du FBAI est de constituer un foie auxiliaire en laissant en place le foie du receveur. Son principe repose sur la transplantation d'hépatocytes, préalablement isolés, à l'intérieur de l'organisme du receveur. Ces hépatocytes peuvent avoir plusieurs origines : ils peuvent être syngéniques et provenir d'une hépatectomie partielle chez le receveur (autotransplantation] ; ils peuvent être allogéniques et provenir d'un donneur vivant ou d'un greffon hépatique réduit en vue d'une transplantation. Enfin, il peut s'agir d'hépatocytes xénogéniques provenant d'animaux, et plus particulièrement du porc qui semble être l'animal le plus adapté [7, 8]. Les hépatocytes ainsi isolés sont ensuite transplantés à l'intérieur de l'organisme du receveur, soit sous forme libre, soit fixés sur des supports formés de dextran ou de PTFE [9], soit dans des capsules constituées d'une membrane semi-perméable qui les protège de l'attaque immunitaire du receveur tout en préservant leurs possibilités d'échanges métaboliques. Ils sont facilement explantables lorsque leur utilisation n'est plus nécessaire. Les produits du métabolisme hépatique, synthétisés par les hépatocytes transplantés, normalement évacués dans les voies biliaires, sont éliminés directement dans le sang, par l'intermédiaire des vaisseaux de l'organe ayant servi de site d'accueil.

Préparation des hépatocytes

o Origine des hépatocytes

Les hépatocytes sont le plus souvent isolés à partir d'un individu sain qui peut être soit de même génotype (FBAI syngénique), soit de génotype différent mais de même espèce (FBAI allogénique), ou provenir d'une espèce différente (FBAI xénogénique). Lorsque les hépatocytes sont syngéniques, il n'y a pas de rejet, mais ce cas aura probablement peu d'applications cliniques. Dans les deux autres cas, les cellules peuvent faire l'objet d'un rejet allogénique de type cellulaire ou d'un rejet xénogénique hyperaigu de type humoral.
Les hépatocytes peuvent aussi être obtenus à partir de lignées entretenues constituées de cellules immortalisées en culture. Ces lignées poussent facilement en culture et permettent l'obtention d'une masse cellulaire importante. Cependant, il s'agit le plus souvent de lignées de cellules cancéreuses, et leur utilisation expose, en cas de passage dans la circulation générale, au risque théorique de cancer induit [6]. Elles ne peuvent donc être utilisées qu'en circuit extracorporel ou après avoir été encapsulées. Des lignées de cellules immortalisées non cancéreuses permettraient d'éviter ce risque.

o Dissociation hépatique

C'est le plus souvent le rat qui a été utilisé expérimentalement comme donneur d'hépatocytes en raison de son faible coût. Le principe de la dissociation est d'isoler les hépatocytes du reste du parenchyme par digestion enzymatique, par perfusion in situ du foie entier ou de fragments hépatiques. La dissociation du foie à la collagénase a été décrite par Seglen [10]. Dans un premier temps, la veine porte est canulée et perfusée à 37 °C par un tampon permettant la rupture des jonctions intercellulaires. Puis la solution de dissociation contenant la collagénase associée à du calcium est perfusée jusqu'à l'obtention d'une digestion hépatique complète. Le foie est ensuite prélevé, la capsule de Glisson retirée et les cellules sont dispersées par simple agitation. La suspension cellulaire est ensuite filtrée puis lavée. La dissociation peut être également obtenue par une perfusion portale d'un tampon contenant de l'EDTA, oxygéné et chauffé à 37 °C [11]. A l'issue de la perfusion, le foie est prélevé et découpé dans un tampon contenant du calcium. Une purification des hépatocytes est ensuite effectuée par centrifugation sur Percoll, permettant d'éliminer les cellules mortes et non parenchymateuses. Pour les gros animaux, bien que coûteuse, la dissociation à la collagénase peut être utilisée avec un bon rendement [12, 13]. La dissociation des hépatocytes par perfusion in situ de collagénase est la méthode la plus utilisée car elle donne une viabilité cellulaire équivalente à celle obtenue par l'EDTA avec un rendement supérieur. De plus, elle peut être utilisée pour préparer des hépatocytes humains à partir de biopsies chirurgicales.

Conservation des hépatocytes isolés

Malgré des progrès récents, la conservation des hépatocytes isolés pose encore de nombreux problèmes techniques. Les hépatocytes peuvent survivre seulement quelques heures en suspension et quelques jours en culture. La prolongation de ce temps de conservation pourrait permettre de constituer des banques d'hépatocytes facilement utilisables. Actuellement la solution UW (University of Wisconsin) permet une conservation d'un foie entier qui n'excède pas 20 heures. Les conditions de conservation doivent préserver, non seulement la viabilité, mais aussi l'activité fonctionnelle et la différenciation cellulaire. La conservation des hépatocytes isolés peut faire appel soit à la culture cellulaire, soit à la cryopréservation à - 196 °C. Cette dernière méthode a donné des résultats encourageants [14], mais s'accompagne d'une diminution de 50 % de la viabilité après 1 mois. Actuellement, la seule méthode qui semble permettre de conserver les hépatocytes plusieurs mois sans altération de leur activité fonctionnelle est la cryopréservation de cellules préalablement micro-encapsulées. En effet, la micro-encapsulation semble protéger les cellules des effets néfastes de la cryopréservation [15, 16].

Site d'implantation

Le site d'accueil idéal du FBAI doit être facilement accessible, offrir un volume important, contenir des facteurs hépatotrophiques et permettre une individualisation facile des hépatocytes transplantés pour pouvoir les différencier du reste du parenchyme hépatique. Plusieurs sites ont été utilisés et des hépatocytes ont été injectés dans le muscle, le pannicule adipeux, le poumon et sous la capsule rénale. Les études les plus récentes ont utilisé, pour la plupart, la rate et le pancréas, le foie et le péritoine.

o La rate

La rate est facilement accessible et permet d'étudier aisément les cellules transplantées. En effet, les hépatocytes forment des travées avec des sinusoïdes facilement reconnaissables et des canalicules biliaires. L'implantation dans la rate permet de mettre des hépatocytes à proximité du sang portal, ce qui pourrait leur assurer un contact avec des facteurs de croissance. Afin d'éviter une fuite massive par voie portale, les hépatocytes doivent être transplantés par injection intraparenchymateuse directe [17]. Après transplantation intrasplénique d'hépatocytes syngéniques, une survie pouvant atteindre 16 mois chez le rat [14] et 7 mois chez le porc [12] a été observée. Panis et al. [18] ont montré qu'un an après transplantation intrasplénique d'hépatocytes isolés, deux activités métaboliques spécifiques de l'hépatocyte étaient conservées : la clairance de l'antipyrine et la synthèse de l'albumine. Plus récemment, la transplantation intrasplénique d'hépatocytes humains allogéniques a permis à trois patients, atteints d'une insuffisance hépatique terminale, d'attendre un greffon hépatique, pendant une période de plus 5 jours [19]. Cependant, la rate ne permet l'implantation que d'un nombre limité d'hépatocytes (0,4 à 1 ml d'une suspension à la concentration 107/ml) et nécessite l'utilisation d'hépatocytes, le plus souvent syngéniques. Enfin, le risque de thrombose porte et d'infarctus splénique est élevé [17].

o Le pancréas

Le pancréas pourrait être un site intéressant pour la transplantation d'hépatocytes, en permettant l'écoulement de la bile dans le duodénum par l'intermédiaire du canal de Wirsung. La transplantation d'hépatocytes syngéniques dans le pancréas n'a pas entraîné de pancréatite [20]. De plus, la transplantation conjointe d'hépatocytes et d'îlots de Langerhans suggère que les îlots de Langerhans sécrètent des facteurs de croissance bénéfiques pour la survie et la prolifération des hépatocytes [20]. Cependant, le pancréas qui ne permet que l'implantation d'un petit nombre de cellules n'est pas très utilisé actuellement par les différentes équipes.

o Le foie

Le foie, par son architecture unique, est en théorie le meilleur site puisqu'il permet une interaction facile entre les cellules transplantées et les facteurs hépatotrophiques. Cependant, il a pour principal inconvénient de ne pas permettre une individualisation aisée des hépatocytes transplantés par rapport au reste du parenchyme hépatique. Plus récemment, Gupta et al. [21] ont utilisé des hépatocytes transfectés exprimant à leur surface l'antigène de l'hépatite B, permettant une individualisation plus facile des cellules transplantées au sein du parenchyme hépatique.

o Le péritoine

Dans le péritoine, les hépatocytes doivent être fixés sur des particules de dextran recouvertes de collagène (micro-porteurs) pour pouvoir survivre [22]. Ces microporteurs offrent une grande surface d'attache pour les hépatocytes, et favorisent la néovascularisation au sein du péritoine, mais ne protègent pas les hépatocytes d'une réaction immunologique de rejet. L'utilisation de micro-porteurs a permis à Demetriou et al. [23] d'obtenir une suppléance hépatique jusqu'à 6 jours chez des rats analbuminémiques et chez des rats Gunn ayant reçu des hépatocytes allogéniques. Kashani et al. [24] ont mis en évidence, chez la souris, la prolifération d'hépatocytes syngéniques encapsulés 1 mois après leur transplantation intrapéritonéale. Le péritoine permet d'implanter un plus grand nombre d'hépatocytes, et de placer les hépatocytes dans des capsules ou sur des supports. Son utilisation semble plus adaptée à l'application clinique.

L'encapsulation

Si les travaux expérimentaux effectués jusqu'ici ont montré l'intérêt de la transplantation d'hépatocytes isolés, la plupart des études ont utilisé des hépatocytes syngéniques. Les hépatocytes allogéniques sont rapidement rejetés, alors que c'est précisément la transplantation d'hépatocytes allo- ou même xénogéniques qui peut avoir des applications cliniques. Les hépatocytes normaux expriment faiblement les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et peu ou pas les molécules de classe II. Malgré l'absence d'expression du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, les hépatocytes sont antigéniques et rejetés en 4 ou 7 jours en l'absence d'un traitement immunosuppresseur [25].
Pour permettre la transplantation de cellules allogéniques sans traitement immunosuppresseur, la microencapsulation a été initialement décrite par Chang [26] pour la transplantation d'îlots de Langerhans. Cette méthode a été utilisée plus tard pour transplanter les hépatocytes dans le péritoine. Le principe est de protéger les hépatocytes de l'attaque immunitaire du receveur par une membrane semi-perméable, tout en préservant les possibilités d'échanges des cellules implantées. De plus, cette membrane doit être biocompatible pour le receveur. Le procédé d'encapsulation est variable : les hépatocytes peuvent être encapsulés isolément, ou en petit nombre, par la membrane ; il est possible également d'introduire les hépatocytes dans une macrocapsule préalablement fabriquée. Les premières membranes utilisées étaient formées avec des sels d'alginate [26] qui entraînaient à terme une fibrose capsulaire. Afin de diminuer cette réaction inflammatoire, les capsules ont été recouvertes de groupes aminés ou d'ammonium quaternaire. D'autres membranes à teneur hydrique très élevée (Hydrogel) ont été obtenues à partir d'un copolymère utilisé en clinique comme membrane d'hémodialyse [27]. La biocompatibilité de cet hydrogel est excellente et les hépatocytes encapsulés dans ce type de biomatériau sont facilement explantables (figure 1). De plus, des hépatocytes syngéniques et allogéniques ainsi encapsulés ont survécu pendant une période de 3 mois, en l'absence de traitement immunosuppresseur [28]. La figure 2 montre des hépatocytes allogéniques, ainsi encapsulés, bien conservés avec des noyaux nucléolés et un cytoplasme contenant de nombreuses vacuoles de sécrétion, 3 mois après leur transplantation intrapéritonéale. D'autre part, ces mêmes hépatocytes, qu'ils soient syngéniques ou allogéniques, étaient encore capables de synthétiser de l'albumine (tableau 1).

Applications thérapeutiques expérimentales

Correction d'un déficit enzymatique

L'utilisation, comme receveurs, d'animaux ayant un déficit enzymatique permet de détecter la présence d'hépatocytes fonctionnels par dosage chez le receveur de substances non synthétisées auparavant. Plusieurs modèles animaux de déficit enzymatique ont été utilisés. Ainsi, la transplantation d'hépatocytes allogéniques encapsulés dans le péritoine a permis d'obtenir la synthèse de bilirubine conjuguée chez le rat Gunn, déficient en uridine diphosphate glucuronyltransférase normalement responsable de la conjugaison de la bilirubine [29]. Cependant, cette activité s'estompait progressivement et, 11 semaines après la transplantation, la bilirubinémie des animaux traités était comparable à celle du groupe témoin (figure 3). Un résultat similaire a été obtenu après transplantation d'hépatocytes xénogéniques. Des hépatocytes humains ont été utilisés chez le rat Nar (analbuminémique), athymique [30]. La transplantation intrapéritonéale d'hépatocytes allogéniques chez le lapin Watanabe (déficient en récepteur aux LDL) a été accompagnée d'une diminution de la concentration sérique de cholestérol [31]. Dans ces modèles d'animaux déficients, la difficulté est de ne mesurer que l'activité fonctionnelle des hépatocytes transplantés et non pas l'activité résiduelle du foie du receveur ou d'hépatocytes ectopiques. Par exemple, du fait de l'existence d'hépatocytes fonctionnels extraspléniques ayant migré lors de l'implantation du FBAI, il peut persister une synthèse de bilirubine conjuguée chez un rat Gunn après explantation d'un FBAI intrasplénique [32]. La mesure d'une enzyme hépatique dans le poumon d'animaux ayant reçu un FBAI intrapulmonaire permettrait peut-être d'éviter ces problèmes, puisque cette activité enzymatique ne peut être attribuée à des cellules pulmonaires.

Correction d'une insuffisance hépatique aiguë

o Modèle animal d'insuffisance hépatique aiguë

L'insuffisance hépatique aiguë peut être induite chez l'animal soit chimiquement, soit chirurgicalement. L'hépatite fulminante peut être induite chez le rat par administration de diméthylnitrosamine [33] ou de D-galactosamine [34] qui sont des produits sélectivement hépatotoxiques. L'utilisation du paracétamol dans l'induction chimique d'une insuffisance hépatique aiguë chez l'animal est en cours d'expérimentation.
L'insuffisance hépatique aiguë peut être également obtenue chirurgicalement soit par une hépatectomie d'au moins 75 %, soit par ischémie hépatique. Sommer et al. [35] ont obtenu une mortalité de 80 % chez le chien, par occlusion de la veine porte et de l'artère hépatique 48 heures après la réalisation d'une anastomose porto-cave et d'une lobectomie gauche. Chez le porc, le modèle d'insuffisance hépatique aiguë le plus utilisé est irréversible et associe une anastomose porto-cave termino-latérale et une ligature du pédicule hépatique [36]. Minato et al. [22] ont utilisé, chez le rat, l'hépatectomie de 75 % associée à une anastomose porto-cave avec de bons résultats. Cependant, ces modèles chirurgicaux sont plus difficiles à utiliser pour évaluer l'efficacité du FBAI, parce qu'ils sont le plus souvent irréversibles et les animaux meurent rapidement d'une hypoglycémie profonde postopératoire. Plus récemment, Roger et al. [37] ont mis au point un modèle chirurgical fiable et reproductible chez le rat en réalisant une hépatectomie de 95 %. L'hypoglycémie était corrigée par du glucosé à 20 % en eau de boisson et par des injections intrapéritonéales de glucose à 5 %. De plus, ce modèle a pour avantage d'être réversible puisqu'une régénération complète du foie natif a été constatée chez les animaux survivants.

o Résultats du FBAI

La correction du déficit hépatique par FBAI peut être appréciée par la prolongation de la survie par rapport à un groupe témoin. Makowka et al. [38] ont constaté une amélioration sensible de la survie, que les hépatocytes soient syngéniques, allogéniques ou xénogéniques dans les deux types d'hépatites aiguës, chimique et chirurgicale. Mais un FBAI intrasplénique n'a pas augmenté la survie des rats après hépatite aiguë à la D-galactosamine ; l'injection de cytosol ou de surnageant de culture hépatocytaire avait le même effet que la transplantation d'hépatocytes isolés [39]. Sommer et al. [34] ont rapporté une prolongation de la survie de rats Gunn après transplantation d'hépatocytes syngéniques, mais sans correction de l'hyperbilirubinémie. Minato et al. [22] ont observé une augmentation de survie chez les rats ayant reçu des hépatocytes syngéniques, 3 jours avant une hépatectomie de 70 %, mais la viabilité des hépatocytes transplantés n'avait pas été vérifiée ; le rôle potentiel du cytosol, du surnageant, ou des cellules mortes n'avait pas été étudié. Plus récemment une étude [40] réalisée chez le rat a montré que le FBAI intrapéritonéal utilisant des hépatocytes allogéniques permettait de faire passer le taux de survie de 7 % dans le groupe témoin à 61 % dans le groupe transplanté, après une hépatectomie de 95 % (figure 4). De plus, une régénération complète du foie natif était observée chez les animaux survivants. Un résultat comparable était obtenu après transplantation d'hépatocytes xénogéniques.

Correction d'une insuffisance hépatique chronique

La cirrhose au tétrachlorure de carbone a été largement utilisée comme modèle d'insuffisance hépatique chronique. Cependant, ce n'est pas un modèle idéal de cirrhose car d'une part le cycle de l'urée n'est pas déprimé et, d'autre part, l'encéphalopathie chronique associée est caractérisée par des troubles très variables. Ribeiro et al. [41] ont montré que, chez des rats ayant une encéphalopathie hépatique chronique induite par une anastomose porto-cave termino-latérale, les troubles du comportement étaient corrigés par un FBAI intrasplénique : 3 mois après la transplantation, l'activité locomotrice et exploratoire des rats initialement en encéphalopathie rejoignait le niveau des témoins. En revanche, l'hyperammoniémie n'était pas corrigée. L'injection préférentielle d'hépatocytes péri-portaux, alors que ce sont les hépatocytes centrolobulaires qui métabolisent l'ammoniaque, pourrait expliquer cette discordance.

Applications humaines dans l'avenir

Ces études expérimentales, développées depuis un vingtaine d'années, confirment l'intérêt du FBAI. Son implantation chirurgicale est simple et son explantation après utilisation est facile. On peut envisager de conserver les hépatocytes d'un même donneur dans une "banque d'hépatocytes". Ils pourraient provenir d'animaux, et dans ce cas, être préparés à la demande, sans recourir à des méthodes de conservation. La mise au point de xénogreffe d'hépatocytes devrait ouvrir de grandes possibilités thérapeutiques. L'utilisation du FBAI pourrait être envisagée dans différents types de déficit hépatique.
En cas de maladie métabolique, le FBAI utilisant des hépatocytes allo- ou xénogéniques provenant d'un donneur sain pourrait être envisagé pour corriger le déficit enzymatique. Par ailleurs, des hépatocytes transfectés pourraient être utilisés à la condition que la maladie métabolique soit génétiquement connue et récessive. Les cellules autologues seraient prélevées par large biopsie ou hépatectomie partielle, transfectées in vitro, puis réinjectées in situ ou dans un autre site. Des protocoles humains ont déjà été proposés [42]. A partir des résultats expérimentaux obtenus chez le rat Gunn, il est possible d'envisager la transplantation d'hépatocytes transfectés avec l'ADNc codant pour la bilirubine-UDPGT dans la maladie de Crigler-Najjar.
De la même manière, le FBAI pourrait être proposé pour le traitement de l'hypercholestérolémie familiale. D'autres déficits, actuellement traités par transplantation hépatique orthotopique, pourraient bénéficier du FBAI : déficit en alpha-1-anti-trypsine et certaines mucoviscidoses. Cependant, la transfection se heurte encore au niveau d'expression des gènes transfectés, ce qui incite à étudier le transfert de gènes associés à des séquences régulatrices qui permettrait d'obtenir une activité métabolique suffisante des hépatocytes transfectés.
Pour une insuffisance hépatique aiguë transitoire ou une insuffisance hépatique en attente de transplantation hépatique, le FBAI apparaît comme une alternative séduisante permettant de passer "un cap", le temps de la régénération du foie natif ou de l'attente du donneur. D'autre part, il permettrait d'éviter l'immunosuppression à vie et ses conséquences.
Pour l'insuffisance hépatique chronique, le FBAI ne supprime pas l'hypertension portale mais peut corriger en partie la fonction hépatique. A partir d'hépatocytes autologues il ne paraît pas indiqué puisque les hépatocytes seraient issus d'un foie malade. En revanche, le FBAI utilisant des hépatocytes allogéniques provenant d'un foie sain, ou même xénogéniques protégés par macroencapsulation, pourrait être mieux adapté. De plus, des hépatocytes allo- ou xénogéniques transfectés pourraient aussi être utilisés pour diminuer le rejet immunitaire.

CONCLUSION

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