ARTICLE
Auteur(s) : Julie Kerr-Conte, Thomas
Hubert, François Pattou
Inserm U859, Thérapie Cellulaire du Diabète, pôle recherche,
faculté de médecine, 3e étage Est, université
Lille-II, 1, place de Verdun, 59045 Lille cedex, France
La seule technique permettant, aujourd’hui, la normalisation
prolongée de l’équilibre glycémique d’un patient atteint de diabète
de type 1 est la restauration d’une insulinosécrétion endogène par
allogreffe de tissu pancréatique.
Allogreffe d’îlots en 2008
Au prix d’un traitement immunosuppresseur continu, la greffe d’un
pancréas vascularisé permet ainsi de normaliser durablement la
glycémie, de ralentir la progression de la neuropathie et de faire
régresser la néphropathie diabétique. La morbidité importante
de cette technique chirurgicale lourde limite, cependant, son
application chez des patients diabétiques non insuffisants rénaux
[1]. L’allogreffe d’îlots, qui repose sur la transplantation
exclusive des îlots endocrines, soit quelques millilitres de tissu,
isolés à partir de pancréas de sujets non diabétiques et infusés
dans la veine porte, suscite depuis quelques années d’importants
espoirs [2].
L’utilisation de protocoles d’immunosuppression dépourvus de
corticoïdes a permis, depuis huit ans, une amélioration
spectaculaire des résultats cliniques de l’allogreffe d’îlots de
Langerhans [3], aujourd’hui confirmée par quelques équipes dans le
monde [2], dont le CHRU de Lille [4]. La greffe intraportale
d’une quantité importante d’îlots, généralement obtenue à partir de
plusieurs donneurs, permet, dans les centres les plus expérimentés,
d’obtenir des résultats identiques à court terme à ceux de la
greffe de pancréas (80 % d’insulino-indépendance à un an). Chez ces
patients, la restauration de l’insulinosécrétion permet, au prix
d’une morbidité acceptable, de normaliser la glycémie et d’obtenir
un équilibre glycémique supérieur à celui obtenu par
insulinothérapie intensive, y compris par infusion continue
intrapéritonéale [5]. Malgré la décroissance progressive de la
masse d’îlots fonctionnels et la nécessaire réintroduction de
petites doses d’insuline, l’équipe canadienne d’Edmonton,
investigatrice du protocole immunosuppresseur sans corticoïde, a
confirmé que la fonction des îlots et la normalisation de
l’équilibre glycémique se maintenaient à cinq ans chez 80 % des
patients [6].
Facteurs limitants
Le développement clinique de la thérapie cellulaire du diabète est
donc crucial et se heurte aujourd’hui à trois obstacles majeurs :
le rejet immunitaire, la faible implantation initiale des îlots et
la durée limitée de leur fonction chez le receveur.
Rejet
Le protocole immunosuppresseur de l’équipe d’Edmonton, qui associe
une induction par le daclizumab à de faibles doses de sirolimus et
de tacrolimus, permet de prévenir au moins à court et moyen termes
le rejet allogénique et auto-immun des îlots greffés chez plus de
80 % des patients [3]. Même si sa morbidité apparaît acceptable au
moins à court terme [7], elle limite cependant les indications de
l’allogreffe aux patients atteints des formes les plus sévères du
diabète de type 1 ou déjà transplantés d’un rein. Plusieurs essais
sont envisagés pour tester de nouveaux protocoles
immunosuppresseurs, voire des stratégies alternatives visant à
éviter l’immunosuppression prolongée en favorisant la tolérance [8]
ou en protégeant les îlots du système immunitaire par encapsulation
[9]. Si pour l’instant aucune de ces techniques n’a fait la preuve
de sa supériorité par rapport au protocole d’Edmonton, on peut
raisonnablement attendre, prochainement, des progrès majeurs
susceptibles d’élargir significativement les indications de
l’allogreffe d’îlots.
Comme pour d’autres types d’allogreffes [10], la fonction
initiale des îlots greffés semble un déterminant essentiel des
résultats à court terme comme à long terme. La faible masse de
tissu endocrine effectivement fonctionnelle chez le receveur semble
largement contribuer aux résultats insuffisants de l’allogreffe
d’îlots. Évaluée in vivo chez les receveurs insulino-indépendants
après stimulation de la sécrétion d’insuline par l’arginine [5], la
masse d’îlots fonctionnelle ne dépasse pas 20 à 50 % de celle des
sujets non diabétiques. Comme dans le diabète de type 2 ou après
pancréatectomie partielle, en dehors de toute agression
immunologique, cette masse insuffisante d’îlots ne peut maintenir
la normoglycémie qu’au prix d’une sécrétion accrue de pro-insuline
; elle décroît en outre inexorablement avec le temps.
La toxicité des immunosuppresseurs et leur concentration
élevée dans l’effluent veineux portal contribuent vraisemblablement
à accélérer encore ce phénomène [11].
En attendant le développement de sources alternatives de tissu
insulinosécrétant humain ou animal, les îlots continueront à
provenir, dans les années à venir, de donneurs en état de mort
encéphalique. En dehors de quelques patients sélectionnés pour
leurs très faibles besoins en insuline [12], la greffe d’un grand
nombre d’îlots (> 10 000 îlots/kg) est nécessaire pour atteindre
l’insulino-indépendance et impose l’utilisation de plusieurs
donneurs. Étant donné la pénurie structurelle des dons d’organes,
dépasser ce paradigme pour transplanter un receveur à partir de
chaque pancréas constitue un enjeu important pour développer la
greffe d’îlots dans les cinq années à venir.
Faible implantation initiale
Dans les centres les plus expérimentés, le déterminant essentiel du
nombre d’îlots isolés à partir d’un pancréas semble être la masse
d’îlots du donneur [13]. Seule une sélection drastique des donneurs
permettrait donc d’augmenter significativement le rendement
quantitatif de l’isolement avec les techniques disponibles,
limitant en retour le nombre de greffons potentiels [13]. À défaut
d’augmenter leur nombre, on peut envisager d’accroître la qualité
des îlots implantés. Les conditions du prélèvement et de la
conservation du pancréas sont essentielles [14], mais seul le
prélèvement à partir de donneurs vivants [15] permettrait de les
modifier radicalement. La culture des îlots durant quelques
heures à quelques jours avant la greffe semble, en revanche,
susceptible d’améliorer leurs caractéristiques [16]. Facilitant
considérablement les aspects logistiques de la greffe, elle est
aujourd’hui envisagée par un nombre croissant de centres.
N’ayant pas de tests in vitro permettant de prédire la fonction
in vivo des îlots isolés, notre équipe a mis au point un essai in
vivo chez la souris immunodéficiente non diabétique, permettant
d’évaluer la fonction de chaque préparation d’îlots humains (QIVIPA
: quantitative in vivo islet potency assay) [17]. Ce test
quantitatif donne plus d’informations que la guérison du diabète,
utilisée par la plupart des laboratoires, car le c-peptide humain
peut être dosé (pas de croisement avec le c-peptide murin). Ce
modèle est pertinent cliniquement car pour une préparation d’îlots
donnée, les résultats obtenus chez la souris sont corrélés avec
leurs fonctions chez l’homme [17]. La figure 2 montre une greffe
d’îlots sous la capsule rénale six semaines après
transplantation.
Parallèlement à l’augmentation du nombre et de la qualité des
îlots greffés, l’autre voie susceptible d’accroître la fonction
initiale du greffon est l’optimisation de leur implantation chez le
receveur. Quel que soit leur site d’implantation, la greffe d’îlots
déclenche, en effet, une intense réaction inflammatoire non
spécifique responsable de la destruction rapide d’une grande partie
des cellules (IBMIR : instant blood mediated inflammatory reaction)
[18]. Différentes estimations suggèrent que moins de 50 % des îlots
infusés dans la veine porte s’implantent et survivent effectivement
chez le receveur [18]. Cette réaction initiale, qui favorise aussi
leur destruction ultérieure par l’immunité spécifique auto-immune
et allogénique, semble particulièrement intense dans le foie qui
est pourtant le seul site de greffe d’îlots dont l’efficacité a pu
être démontrée chez l’homme [3]. Une des particularités du site
intraportal, l’infusion des îlots dans le flux sanguin, semble
susceptible d’expliquer ces résultats. Plusieurs études in vitro
ont en effet montré que les îlots activent les cascades de la
coagulation et de l’inflammation au contact du sang allogénique. En
étudiant ce phénomène chez le porc, nous avons pu préciser in vivo
les caractéristiques de cette réaction, après allogreffe
intraportale de tissu pancréatique [19].
Les déterminants de cette réaction ne sont pas encore élucidés.
L’hypothèse initiale de l’équipe suédoise impliquant la voie
intrinsèque de la coagulation après activation des plaquettes au
contact des îlots n’a pas été confirmée chez l’homme. Quels qu’en
soient les mécanismes intimes, l’effet délétère de cette activation
de la coagulation pour l’implantation et la survie des îlots a été
suggéré chez l’homme [20] et a été démontré dans un modèle
expérimental de greffe intraportale [19]. Nous avons, de plus,
récemment confirmé, chez des patients diabétiques non insuffisants
rénaux, la corrélation significative entre l’élévation des
complexes thrombine-antithrombine (TAT) au décours de la greffe et
la destruction initiale des îlots, reflétée par l’élévation
immédiate et transitoire (six heures) du c-peptide.
Les protocoles de greffe d’îlots intrahépatique visent
actuellement à diminuer cette réaction clinique inflammatoire et
procoagulante [18].
Cette réaction initiale a placé la recherche d’un site
alternatif au centre des débats actuels [21]. Par ailleurs, la
toxicité des immunosuppresseurs, leur concentration élevée dans
l’effluent veineux portal et la proximité des cellules
transplantées avec des macrophages résidants et les cellules de
Küpffer participent à la perte progressive de fonction du
greffon.
La greffe d’îlots de Langerhans est devenue une option
thérapeutique dans le traitement du diabète. Néanmoins, le site
d’implantation hépatique présente de nombreux risques et
inconvénients, responsables d’une morbidité non négligeable.
Les nouveaux sites développés doivent au mieux répondre à
certains critères pour assurer un bénéfice par rapport au site de
référence actuel : une efficacité au moins équivalente, une
technique de greffe moins morbide, une perte d’îlots moins
importante lors des premiers jours de greffe, une revascularisation
des îlots rapide et adéquate et peu d’effets secondaires et de
complications à long terme. De nombreux sites alternatifs ont
fait leurs preuves sur au moins quatre de ces critères chez le
rongeur. Néanmoins, peu d’entre eux ont pu être reproduits
formellement chez l’homme.
Durée limitée de la fonction
La fonction de la greffe d’îlots décroît avec le temps (80 % à un
an, 70 % à deux ans, 20 % à cinq ans) dans la plupart des centres.
Les analogues du GLP-1 ou inhibiteurs de dégradation sont en
cours d’évaluation dans l’allogreffe d’îlots [22, 23].
Ils semblent, dans deux études cliniques, faciliter
l’insulino-indépendance avec un greffon quantitativement moindre,
mais l’effet s’arrête quand le traitement est interrompu. D’autres
études plus approfondies sont actuellement réalisées au niveau
international, visant à prolonger de façon significative la
fonction des îlots greffés.
Données quantitatives
Si ces résultats actuels se confirment, l’allogreffe d’îlots
pourrait progressivement se substituer à la greffe de pancréas et
constituer une alternative thérapeutique validée chez les patients
atteints des formes les plus sévères du diabète de type 1, soit
environ dix patients par million d’habitants et par an. En 2006,
l’allogreffe intraportale était déjà prise en charge par
l’assurance maladie en Belgique, en Suisse et au Canada (Alberta).
Aux États-Unis, 27 centres développent actuellement un programme
clinique d’allogreffe d’îlots, et cette technique est en cours de
validation par la US FDA (United States Food and Drug
Administration), en particulier chez les patients greffés d’un
rein. En France, l’allogreffe d’îlots figure déjà dans la
nomenclature des actes médicaux (CCAM-HNEH001) mais n’est pas
encore valorisée dans le cadre de la tarification à l’activité
(T2A). Son évaluation médico-économique est en cours avec le
soutien de l’Alfediam (projet DIACELL) et fait l’objet d’un PHRC
national. Comme pour les autres transplantations, il s’agira
nécessairement d’une technique coûteuse [24].
L’enthousiasme initial de 2000, suite à la publication du
protocole d’Edmonton [3], a partiellement décru. Certains centres
trouvent le moment actuel décisionnel pour la greffe d’îlots [25].
Sa reproductibilité est faible, et la technique est limitée aux
laboratoires les plus expérimentés, dont le nôtre.
L’insulino-indépendance diminue avec le temps, et les
immunosuppresseurs actuels empêchent la prolifération des cellules
pancréatiques [26], d’où une diminution inexorable de la fonction
et une sensibilisation observée chez des receveurs, pouvant
empêcher une greffe ultérieure. Le nombre de pancréas
nécessaires par patient diabétique receveur soulève des débats
éthiques, car les pancréas destinés à l’isolement d’îlots sont
retirés du pool de pancréas destiné à l’allogreffe pancréatique.
La figure 1
montre le faible pourcentage de pancréas prélevés en France (128
pour la greffe plus 86 pour l’isolement d’îlots, en 2007, sur 1 562
donneurs en état de mort encéphalique prélevés). Certains centres
arrêtent leur activité, d’autres se penchent sur la redéfinition du
but de la greffe d’îlots, moyen efficace permettant de corriger les
hypoglycémies même en l’absence d’insulino-indépendance.
Les premiers résultats de l’allogreffe d’îlots ont permis de
valider le concept de la thérapie cellulaire du diabète. Malgré les
réticences théoriques, la preuve du concept est acquise [27].
Les progrès prévisibles des stratégies de greffe et de
prévention du rejet immunitaire laissent envisager une extension de
ses indications dans les années à venir, en particulier chez les
patients atteints des formes les plus sévères du diabète de type 1.
La pénurie structurelle des donneurs d’organes et le rendement
limité des techniques d’isolement d’îlots primaires disponibles
limiteront, cependant, inexorablement, le développement de
l’allogreffe d’îlots primaires.
Source alternative de cellules insulinosécrétrices
Depuis 2000, la reconnaissance du potentiel de la thérapie
cellulaire dans le traitement du diabète a suscité l’engagement de
très nombreuses équipes de recherche académiques et privées dans la
production de cellules insulinosécrétrices, en vue de leur
transplantation chez l’homme, en particulier à partir de la
prolifération des îlots humains adultes, l’exploitation des
donneurs vivants ou à cœur arrêté, l’obtention des îlots
xénogéniques, la prolifération et la différenciation des cellules
souches et des cellules précurseurs, et la transdifférenciation
[28].
Expansion d’îlots primaires
L’expansion des îlots humains peut atteindre un facteur de 30 000,
mais avec la prolifération viennent la perte de sécrétion
d’insuline et l’expression en ARNm. Les expériences de «
traçage cellulaire », réalisées chez la souris, ont établi que le
turnover et la multiplication d’îlots proviennent uniquement de la
réplication des îlots préexistants [29]. Une différence interespèce
est, néanmoins, soulevée par plusieurs auteurs [30]. Malgré de
nombreuses pistes, aucune technique n’est actuellement disponible
pour expandre les îlots humains qui expriment finalement l’insuline
[31].
Îlots provenant de donneur vivant ou à cœur
arrêté
L’interdiction culturelle d’utiliser les donneurs à cœur battant
dans un état de mort encéphalique a obligé les Japonais à
identifier les nouvelles sources d’îlots issus des donneurs vivants
et à cœur arrêté. La première greffe d’îlots issus d’un
donneur vivant a ainsi été effectuée, en 2005, par une équipe de
Kyoto, entre une mère et sa fille atteinte de diabète secondaire à
une pancréatique chronique [15]. La justification de la greffe
d’îlots provenant de donneurs vivants reste discutable dans
d’autres pays ; malgré les efforts préopératoires évitant les
donneurs à risque, l’hémipancréatectomie est associée, chez 43 %
des donneurs, à un déséquilibre de la glycémie à jeun et à une
intolérance au glucose ou à un diabète [32].
Cellules insulinosécrétrices xénogéniques
En xénotransplantation, les îlots porcins figurent parmi les
organes et tissus les plus probables à une application clinique.
L’utilisation potentielle de cellules animales comporte encore de
nombreuses incertitudes, à la fois physiologiques, immunitaires et
éthiques. Les risques d’épizootie virale semblent proscrire
son utilisation clinique et font l’objet d’exigences réglementaires
[33]. Si le receveur d’une xénogreffe est sous traitement
immunosuppresseur, la possibilité d’une réactivation de virus en
cas de résistance diminuée de l’hôte doit être prise en
considération. À titre d’exemple, la grippe porcine pandémique de
1918-1919 a abouti à 40 millions de décès humains [33].
Les avancées majeures de survie des îlots porcins jusqu’à six
mois greffés chez des primates ont néanmoins été récemment
rapportées par trois centres indépendants [34]. Si deux de ces
centres ont utilisé des régimes immunosuppresseurs estimés non
applicables en clinique, l’équipe de Dufrane a obtenu de bons
résultats précliniques en absence complète d’immunosuppresseur
grâce à l’encapsulation des îlots. Malgré la mise en évidence in
vitro d’une infection des cellules humaines, les études in vivo de
xénogreffe « porc à primate » ne mettent en évidence aucune
transmission de virus porcins. Les essais précliniques chez le
primate sont nécessaires pour mieux établir l’efficacité et la
sécurité de cette technique avant de poursuivre les essais
cliniques « porc à homme ». Les cellules porcines exemptes de
pathogènes, qu’elles soient adultes, fœtales ou néonatales,
constituent, toutes, une option intéressante pour le traitement du
diabète. L’Organisation mondiale de la santé a publié, en 2004, une
résolution recommandant aux États membres l’autorisation des essais
cliniques de xénotransplantation, uniquement si les autorités
nationales de santé avaient mis en place les moyens de contrôle de
cette activité. Une réglementation doit être imposée au niveau
international pour éviter le « xénotourisme » (patients se rendant
dans un pays avec peu ou aucune réglementation, pour bénéficier
d’une xénotransplantation qui ne serait pas autorisée dans leur
propre pays d’origine).
Cellules souches adultes non pancréatiques
La présence de précurseurs ou de cellules ayant des propriétés «
souches » offre la possibilité de stimuler leur expansion et leur
différenciation in vivo ou d’utiliser les cellules bêta issues de
ces cellules pour remplacer les cellules défaillantes chez les
diabétiques de type 1 et de type 2. La littérature compte de
nombreuses publications sur l’obtention de cellules
insulinosécrétrices à partir de cellules souches pancréatiques et
extrapancréatiques [28]. Parmi les différentes sources de cellules
non pancréatiques, on identifie les cellules souches
mésenchymateuses (CSM) humaines provenant de la moelle, du sang de
cordon et de la moelle osseuse. Plusieurs articles contredisent ce
dernier point, montrant en effet que peu de cellules de la moelle
osseuse sont capables de devenir des cellules bêta. Un rôle
paracrine de support a été identifié, facilitant la néoformation
d’îlots dans le pancréas endogène. L’amélioration de l’état
diabétique (réduction de la glycémie et prévention de la
néphropathie) a été observée dès une semaine après injection
systémique unique de cellules stromales mésenchymateuses.
Les modèles précliniques chez le porc commencent à confirmer
l’effet « support » des CSM pour la néoformation d’îlots. Dans le
diabète de type 1, les CSM issues de la moelle osseuse humaine
autologue pourraient ainsi être utiles pour améliorer la
néphropathie et augmenter la régénération des îlots.
Cellules souches adultes pancréas-spécifiques
En 2001, l’équipe d’Habener a décrit une population cellulaire
issue des cultures d’îlots humains ayant un autorenouvellement et
une multipotence (capacité de différenciation vers un phénotype
hépatique, endocrine et exocrine pancréatique).
La particularité de ces cellules était qu’elles exprimaient la
nestine, le marqueur des cellules souches neuronales. L’article a
eu un retentissement important, mais était fortement contesté, lié
à l’absence d’implication de cellules « nestine positive » dans la
néoformation d’îlots en embryogenèse. Plusieurs populations de
cellules précurseurs, voire souches, ont été identifiées en culture
et plus spécifiquement par les marqueurs de surface c-met ou
prominine 1 (CD133). L’extrapolation d’une approche de tri, mise au
point avec le pancréas fœtal de souris, est prometteuse pour
l’identification des progéniteurs exprimant fortement le
neurogénine 3, facteur de transcription clé pro-endocrine.
Le pancréas exocrine et endocrine humain contient aussi une
population de CSM qui montrent cependant une faible capacité de
différenciation en cellules endocrines.
Cellules souches embryonnaires
La nature illimitée de la source de cellules souches embryonnaires
et leur capacité de différenciation ciblée font de ces cellules une
source idéale dans le cadre de l’allogreffe [35]. En 2000, l’équipe
de Soria était la première à avoir mis au point un protocole de
différenciation de cellules souches embryonnaires murines en
cellules insulinosécrétrices ayant abouti à la guérison de l’état
diabétique des souris. D’autres approches ont suivi, notamment le
passage par la sélection en culture de cellules intermédiaires
exprimant la « nestine », marqueur de cellules souches neuronales.
L’efficacité de différenciation était de 15 %, et les cellules
obtenues exprimaient 2 % des taux d’insuline des îlots matures.
Blyszczuk a réussi à augmenter les taux d’efficacité à 80 %, en
surexprimant le facteur de transcription Pax 4 (figure 3) dans ces
cellules et en obtenant la normalisation de la glycémie chez les
souris, pendant deux semaines. Quelques années plus tard, Sipione a
jeté une suspicion sur le phénotype de ces cellules, car elles
n’exprimaient pas le Pdx-1, gène régulateur principal du phénotype
des cellules bêta. Puis Brivanlou et al. ont montré que la
positivité pour l’insuline pourrait venir d’une capture d’insuline,
dans le milieu de culture, par les cellules souches embryonnaires
[36]. La stabilité de la différenciation est remise en
question par Fujikawa qui a montré que la guérison de l’état
diabétique avec les cellules insulinosécrétrices, provenant des
cultures de cellules souches embryonnaires de souris, s’arrête à
trois semaines. L’expression de l’insuline au sein des cellules est
perdue, avec une augmentation concomitante de oct4, marqueur
primitif des cellules souches. Des tératomes, tumeurs bénignes
contenant des cellules différenciées de tissu variable, étaient
observés dans toutes les expériences de transplantation, à
l’exception de celle de Soria, dans laquelle un procédé de capture
de cellules (cell trapping) a été exploité.
Les premières expériences avec les cellules embryonnaires
humaines proviennent de laboratoires situés dans des pays ayant une
réglementation ad hoc (Israël, Suède, Australie). Les cellules
insulinosécrétrices peuvent être obtenues de façon spontanée en
faible nombre, par le procédé de sélection de cellules
intermédiaires « nestine positive » ou par l’incubation des
cultures de cellules souches embryonnaires, en présence de pancréas
embryonnaire, in vivo. En 2005, Novocell, Inc. (San Diego, CA,
États-Unis) a pris de l’avance en publiant, de façon rapprochée, à
trois reprises. Cette entreprise a d’abord défini un procédé
efficace pour obtenir de l’endoderme à partir de cultures de
cellules souches embryonnaires humaines. En exploitant les
connaissances d’embryologie de la littérature, elle a identifié un
procédé complexe qui impliquait cinq stades bien définis (figure 3),
récapitulant les stades d’embryogenèse du pancréas murin [37]. Au
sein de chaque stade, la signature des cellules était profilée au
niveau d’ARNm et de protéines, allant de facteurs de transcription
primitifs vers une cellule bêta endocrine. Les cellules
endocrines humaines obtenues sécrétaient de l’insuline et du
c-peptide humain en réponse aux sécrétagogues, mais ne répondaient
pas au glucose (ni in vitro ni in vivo). Peu de temps après, Geron
Corp. (Menlow Park, CA, États-Unis) a publié son procédé de culture
sans sérum et sans cellules nourricières. L’ensemble des phénotypes
pancréatiques (endocrine, acinus, canal) était observé dans la
culture postdifférenciation, dont moins de 10 % des cellules
étaient positives pour le c-peptide humain. Le taux d’insuline
était faible ou supérieur à celui d’îlots fœtaux peu différenciés.
Début 2008 [38], Novocell a optimisé son protocole de
différenciation publié en fin 2006, en implantant in vivo les
cellules à phénotype épithélial pancréatique n’exprimant pas encore
l’insuline (stade 4). Comme pour le pancréas fœtal humain, la
maturation finale s’est réalisée in vivo chez la souris
immunodéficiente. Trois mois après l’implantation, les taux de
c-peptide, après stimulation par le glucose, étaient équivalents
aux taux obtenus des souris greffées avec îlots humains.
Ce travail établit la preuve que les cellules souches humaines
embryonnaires sont compétentes pour générer les cellules
insulinosécrétrices sensibles au glucose.
Malgré ces résultats très prometteurs, plusieurs obstacles
demeurent. On sait, aujourd’hui, que l’absence d’expression du
complexe majeur d’histocompatibilité constitue un avantage majeur
des cellules souches embryonnaires, mais il apparaît avec la
différenciation cellulaire. Ces cellules embryonnaires posent
d’énormes problèmes éthiques et réglementaires [39] additionnés à
la formation de tératomes in vivo constatés quasi systématiquement
[38].
Cellules souches pluripotentes induites
L’année 2008 a marqué une nouvelle ère [40], avec la naissance de
cellules souches pluripotentes induites suite à une reprogrammation
de cellules humaines adultes. Cette nouvelle approche est
indépendante des ovocytes et embryons humains, libre de conflits
éthiques et politiques. En 2006, Takahashi et al. ont réussi à
reprogrammer les cellules adultes grâce à l’expression forcée mais
transitoire de quatre facteurs de transcription (oct4, sox2, kfl4
et myc). En 2007, les équipes de Takahashi, de Thomson et, plus
récemment, de Park ont réussi à induire cette reprogrammation avec
les cellules humaines. Ces cellules souches pluripotentes
induites ont des similitudes avec les véritables cellules souches
dérivées de l’embryon humain concernant leur morphologie, leur
autorenouvellement, leur expression d’antigènes de surface, leur
expression génique, leur différenciation en trois feuillets
embryonnaires et leur capacité de former des tératomes in vivo.
L’enjeu de cette population cellulaire pour la thérapie cellulaire
en général et, plus précisément, pour le traitement du diabète, est
énorme. Les premières lignées de cellules souches
pluripotentes patient-spécifiques ont été publiées fin 2008 [41],
dont une issue d’un patient diabétique de type 1. Au même moment,
la capacité de différenciation des cellules souches pluripotentes
humaines induites vers des cellules insulinosécrétantes a été
démontrée par une équipe académique américaine [42]. Leur taux de
sécrétion de c-peptide était similaire aux taux sécrétés par les
cellules insulinosécrétantes, dérivées des cellules souches
embryonnaires humaines.
Des études plus approfondies comparant les cellules souches
pluripotentes induites avec les cellules souches embryonnaires sont
nécessaires. Les améliorations souhaitables sont les suivantes
: identification des moyens d’induction sans intégration au génome
(récemment effectuée par Okita et al.), élimination du gène c-myc
(récemment réalisée chez la souris), mise au point d’un moyen
permettant d’éviter la formation de tératomes, augmentation du taux
de différenciation et stabilisation de la différenciation
postimplantation. Le rêve de pouvoir réaliser une biopsie et
produire à large échelle le type cellulaire atteint par la maladie
diabétique est désormais envisageable.
Les perspectives d’application clinique des différentes
approches décrites dans la décennie à venir demeurent incertaines.
Sur le plan scientifique, la reproductibilité des techniques par
des équipes indépendantes constitue la première étape. Sur le plan
réglementaire, l’application clinique des technologies nécessaires
(cytokines ou facteurs de croissance, infection virale) semble
difficile dans le contexte réglementaire strict qui encadre la
thérapie cellulaire en Europe et en Amérique du Nord. L’utilisation
de cellules souches embryonnaires soulève également des
interrogations éthiques non résolues qui disparaissent avec les
cellules pluripotentes induites. En raison de l’enjeu à la fois
économique et sanitaire, la concurrence est absolue, et des moyens
colossaux sont nécessaires pour permettre des avancées rapides.
Induction de transdifférenciation in vitro
et in vivo
Plusieurs types cellulaires possèdent la capacité de
transdifférenciation en cellules insulinosécrétrices : le foie,
l’intestin, les splénocytes (encore controversé) et les acini
pancréatiques. Les expériences in vitro montrent la capacité
des acini de rongeur à transdifférencier à hauteur de 20 %, vers un
phénotype insulinosécrétant aboutissant à la guérison du diabète
[43]. Les expériences de traçage cellulaire confirment cette
différenciation, bien que la pertinence de cette voie reste
discutée. La reproductibilité des protocoles d’induction de
transdifférenciation entre les cellules murines et humaines reste à
démontrer.
Évitant le recours à la transplantation, la transdifférenciation
constitue l’approche la plus récemment envisagée et, en théorie, la
plus séduisante. Il ne s’agit, cependant, encore que d’un
concept, exploré seulement chez le rongeur. Avec trois gènes codant
pour les facteurs de transcription (PDX-1, ngn3, MafA), Melton et
al. ont réussi à transformer 20 % des acini en cellules bêta in
situ, aboutissant à une correction de la glycémie des animaux
diabétiques [44].
Cellules précurseurs pancréatiques humaines
En parallèle du développement de sources alternatives de tissu
insulinosécrétant, la thérapie cellulaire du diabète continuera
vraisemblablement de reposer, dans la prochaine décennie, sur les
cellules pancréatiques allogéniques. Étant donné la pénurie
structurelle des dons d’organes, transplanter au moins un receveur
à partir de chaque pancréas constitue un enjeu majeur de la
thérapie cellulaire du diabète.
Si leur possible différenciation in vivo se confirme, la greffe
clinique de cellules précurseurs pancréatiques humaines (cPPh)
dérivées du tissu exocrine, associées aux îlots, permettrait
d’accroître rapidement et très significativement les indications de
l’allogreffe. La disponibilité en donneurs d’organes dans la
plupart des pays (environ 20 à 30 par million d’habitants et par
an) permettrait alors de faire face à la demande prévisible pour
traiter les patients atteints des formes sévères de diabète de type
1. Dans la perspective de l’application clinique à court terme, la
greffe de cPPh, dont le concept a déjà été validé expérimentalement
par plusieurs équipes indépendantes, constitue un avantage majeur.
L’utilisation de cellules primaires provenant des donneurs en état
de mort encéphalique, déjà autorisée dans le cadre de
l’allotransplantation, et l’absence de manipulation complexe
préalable à la transplantation en particulier génétique, ne
poseraient que peu de difficultés réglementaires.
La validation de ce procédé par un essai clinique pourrait
donc être envisagée rapidement et déboucherait sur la création
d’une ou plusieurs structure(s) de production susceptible(s) de
satisfaire les besoins des centres de greffes cliniques. À plus
long terme, cette technique pourrait également permettre
d’envisager la greffe de cellules issues d’un fragment de pancréas
prélevé chez un donneur vivant [15], voire chez le patient
lui-même.
Bases expérimentales
Au cours du développement, les cellules endocrines pancréatiques se
forment à partir de l’endoderme par prolifération et
différenciation de cellules précurseurs au sein du bourgeon
pancréatique, sous le contrôle de différents facteurs de
transcription [37] (figure 3). Dans certaines
conditions expérimentales (pancréatectomie, ligature du canal de
Wirsung) et dans certaines pathologies humaines (nésidioblastose),
une néogenèse similaire de cellules endocrines par prolifération
puis différenciation de cellules précurseurs, coexprimant CK19 et
PDX-1, a été décrite à l’âge adulte.
Bien que récemment remise en cause par une étude de transgenèse
réalisée chez la souris [29], la réalité de la néogenèse des
cellules insulinosécrétrices, à partir de cellules précurseurs
pancréatiques non endocrines à l’âge adulte, a pu être confirmée.
L’importance de l’expression de neurogénine 3, facteur de
transcription pro-endocrine, au sein des précurseurs présents dans
le canal, semble incontournable pour obtenir ultérieurement les
îlots [45]. Le travail de Xu et al. [45], associé aux travaux
de Minami et al. et de Bonner-Weir et al. [46], met fin à l’idée
dominante que les nouvelles cellules bêta ne pouvaient être
générées qu’à partir des cellules bêta préexistantes.
Nous avons suggéré, dès 1996, que ce phénomène de néoformation
d’îlots à partir de précurseurs canalaires pouvait être reproduit
in vitro afin d’obtenir des cellules insulinosécrétrices humaines
[47], hypothèse, depuis, confirmée de façon indépendante. Or, la
néoformation in vitro de cellules insulinosécrétrices humaines à
partir des cellules canalaires (nésidioblastose) apparaît
quantitativement limitée ex vivo.
Une source abondante de cellules de phénotype canalaire CK19 et
co-exprimant PDX-1 est issue d’une détransdifférenciation des
cellules exocrines pancréatiques humaines [48]. Cette capacité de
prolifération et de différenciation endocrine d’une population
cellulaire abondante dans le pancréas ouvrirait d’importantes
perspectives et a fait l’objet d’un brevet aujourd’hui délivré aux
États-Unis (Kerr-Conte J., US patent 6,900,051,2005).
Suite à notre description de la possible dédifférenciation du
tissu exocrine humain en cPPh, cinq équipes académiques
indépendantes se sont engagées sur ce thème et ont confirmé et/ou
complété nos observations initiales à Bruxelles, Edmonton, Londres,
Los Angeles et San Diego [49]. Ces équipes ont confirmé la
néoformation de cellules exprimant et sécrétant de l’insuline à
partir de cellules précurseurs dérivées du tissu exocrine humain,
dont une avec les expériences convaincantes de traçage cellulaire
pour confirmer la capacité des cPPh à devenir endocrines [49]. Si
la différenciation endocrine de ces cellules semble possible in
vitro, elle reste très inférieure à celle des cellules bêta
primaires. La différenciation des cPPh semble, en revanche,
spontanément favorisée in vivo après transplantation. En clinique,
la cotransplantation involontaire avec les îlots de cellules
précurseurs (CK19/PDX-1) est associée à une meilleure fonction du
greffon au long cours. Expérimentalement, la transplantation de
cPPh encore immatures et issues de tissu pancréatique exocrine
humain permet de restaurer une insulinosécrétion. Chez l’homme, les
cellules pancréatiques canalaires expriment le récepteur pour le
GLP-1, hormone intestinale insulinotrope ou incrétine favorisant
leur différenciation in vitro. Le traitement de souris avec le
GLP-1 et la gastrine améliore la différenciation de cPP [50]. In
vivo, l’infusion des analogues stables du GLP-1 développés pour le
traitement du diabète de type 2 (Exendine 4) provoque la néogenèse
des cellules endocrines à partir de cellules précurseurs
canalaires. L’administration d’analogues stables de GLP-1, déjà
envisagée pour optimiser les résultats de l’allogreffe d’îlots,
permettrait vraisemblablement de favoriser la différenciation des
cPPh. En vue de l’élaboration du protocole d’un essai clinique de
phases 1-2 d’allogreffe combinée de cPPh et d’îlots, notre
laboratoire travaille pour définir des modalités optimales de
transplantation des cPPh, y compris la quantité à transplanter et
le traitement adjuvant.
Les protocoles induisant l’expression de neurogénine 3, facteur
pro-endocrine au sein de cellules à phénotype canalaire et
exprimant le PDX-1, constituent une recherche également prioritaire
dans le domaine.
Conclusion
La thérapie cellulaire allogénique est une option pour les
diabétiques ayant les formes les plus sévères de diabète instable
(et/ou greffés rénaux). De nombreuses pistes sont en cours
d’exploration concernant les cellules souches comme source de
cellules insulinosécrétrices ou comme cellules catalyseurs de
régénération, avec une échéance variable. L’espoir de traitement du
diabète par thérapie cellulaire demeure ainsi au plus haut niveau.
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