Relevance of cytological and immunophenotypical analysis for the diagnosis of B-cell chronic lymphocytic leukaemia

ARTICLE

Le terme d’hémopathies lymphoïdes chroniques B à dissémination sanguine désigne l’ensemble des proliférations clonales qui affectent les cellules matures des lignées lymphoïdes B. Cette définition s’applique à la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie à prolymphocytes (LPL), la leucémie à tricholeucocytes et aux formes leucémiques des lymphomes malins non hodgkiniens à petites cellules (LNH) notamment le lymphome folliculaire, le lymphome du manteau, le lymphome des zones marginales (avec ou sans lymphocytes villeux), le lymphome lymphoplasmocytaire et la leucémie à plasmocytes. La caractérisation de ces hémopathies, telle qu’elle a été proposée en 1989 par le groupe FAB, est basée essentiellement sur l’étude de la morphologie cellulaire au niveau du sang et de la moelle osseuse, associée à celle des marqueurs immunologiques [1]. Le diagnostic cytologique de la LLC repose sur une lymphocytose supérieure à 4 • 109/L présente depuis plus de 3 mois. La LLC typique est caractérisée par la présence d’une population monomorphe de petits lymphocytes matures. La classification FAB définit les différents types de LLC atypiques (ou mixtes) : - la LLC / PL avec une proportion de prolymphocytes comprise entre 10 et 55 % de la population lymphoïde, et des lymphocytes de plus grande taille que ceux de la LLC typique ; - la LLC à grandes cellules B caractérisée par un spectre de petits à grands lymphocytes et la présence occasionnelle de prolymphocytes (moins de 10 %) ; - la LLC mixte avec une proportion de lymphocytes clivés et/ou lymphoplasmocytoïdes supérieure à 15 %. Le lymphocyte de la LLC-B exprime le CD19 (antigène pan-B), le CD5 (antigène pan-T) et le CD23 (antigène d’activation non spécifique). L’expression faible des immunoglobulines de surface (SmIg), le plus souvent de type IgM ± IgD, l’expression faible ou absente du CD22, l’absence d’expression du FMC7 permettent de compléter le descriptif immunologique. Un système de score basé sur l’étude de ces marqueurs a été proposé par l’équipe de Matutes, facilitant ainsi la discrimination entre la LLC et les autres syndromes lymphoprolifératifs [2]. Le résultat de chaque marqueur est additionné pour donner un score de 0 à 5 (tableau 1). L’étude de Matutes définit le score de 2 comme valeur permettant le diagnostic différentiel entre les LLC (score ³ 3) et les autres hémopathies lymphoïdes chroniques B (score ² 2). Nous avons réalisé une étude descriptive des signes cytologiques et immunologiques évocateurs de la leucémie lymphoïde chronique à lymphocytes B afin de déterminer l’aptitude de ces signes à participer au diagnostic différentiel avec les autres hémopathies lymphoïdes chroniques B.

Matériels et méthodes

L’étude a été réalisée sur 92 patients atteints d’hémopathie lymphoïde chronique à cellules B.

L’analyse cytologique

Elle a été réalisée au microscope optique sur frottis sanguin après coloration au May-Grünwald-Giemsa (MGG). Pour chaque patient, nous avons réalisé des " formules lymphocytaires " sur au minimum 300 lymphocytes selon une classification proposée par le GFHC (Groupe français d’hématologie cellulaire) : I : petit lymphocyte mature (figure 1a) : caractérisé par un diamètre de 7 à 8 microns, un haut rapport nucléocytoplasmique, un noyau rond à la chromatine compacte densifiée en trois ou quatre lobes volumineux et un cytoplasme limité à un fin liseré légèrement basophile ; II : grand lymphocyte mature (figure 1b) : diamètre de 12 à 15 microns ; IIIa : cellule lymphoplasmocytaire : noyau excentré et cytoplasme plus abondant et basophile que le petit lymphocyte mature ; IIIb : cellule lymphoïde hyperbasophile : hétérogène morphologiquement allant du petit lymphocyte à la cellule monocytoïde ; IIIc : immunoblaste : cellule nucléolée de taille moyenne à grande ; IV : prolymphocyte (figure 1c) : taille moyenne à grande avec un noyau contenant une chromatine mature relativement bien condensée laissant apparaître un nucléole proéminent en position paracentrale et un cytoplasme modérément basophile ; d c b a V : autres cellules (cellules à noyau clivé, tricholeucocyte, lymphocytes villeux et autres cellules lymphomateuses...). Les large granular lymphocytes (LGL) et ombres de Gumprecht (figure 1d) sont appréciés en comptabilisant le nombre de ces cellules rencontrées lors du décompte de 100 cellules lymphoïdes.

L’analyse immunophénotypique

Elle a été réalisée par cytométrie en flux en immunofluorescence directe. Cette technique permet l’analyse individuelle et multiparamétrée de cellules en suspension en associant une caractérisation morphologique (morphométrie) et une réaction d’immunofluorescence. Les résultats fournis se présentent sous forme d’histogrammes : cytogramme représentant l’étude morphométrique taille/structure, et histogramme biparamétré fournissant le pourcentage de cellules simplement et doublement marquées. La fluorescence totale mesurée est composée de la fluorescence spécifique due aux liaisons antigène-anticorps formées et d’une fluorescence non spécifique. Ce signal non spécifique est mesuré à l’aide d’un " contrôle isotypique ". Les antigènes choisis sont : - le CD3, marqueur des lymphocytes T permettant de définir la proportion de lymphocytes B CD19 positif dans notre population totale ; - le CD5 qui, en situation non pathologique, est exprimé sur le lymphocyte T et une sous population minoritaire de lymphocytes B ; - le CD23 qui apparaît au stade de lymphocyte immature et disparaît sur les plasmocytes, et intervient dans la présentation des antigènes par les lymphocytes B aux lymphocytes T ; - le CD22 qui est exprimé par les cellules B, et dont la structure moléculaire pourrait laisser supposer qu’il s’agit d’une molécule d’adhésion ; - le FMC7, présent sur le lymphocyte B normal ; - les immunoglobulines de surface (chaînes lourdes gamma, mu, alpha, delta et chaînes légères kappa et lambda ; - le CD79b qui est présent sur les lymphocytes B tout au long de leurs stades de maturation et de différenciation, et disparaît des plasmocytes ; - le CD20 qui apparaît sur les cellules B à un stade intermédiaire de maturation dans la moelle osseuse et disparaît au stade plasmocytaire. Nous avons utilisé une technique en double marquage avec un anticorps monoclonal marqué à la phycoérythrine (PE) dirigé contre l’antigène membranaire CD19 (pan-B) et un anticorps monoclonal marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dirigé contre l’antigène membranaire à étudier (figure 2). En respectant la proportion moyenne d’un microgramme d’anticorps par million de cellules, la réaction antigène-anticorps est réalisée en excès d’anticorps, à saturation des sites antigéniques. Quantitativement, le CD5, le CD23 et le FMC7 sont jugés négatifs quand moins de 30 % des cellules lymphoïdes B les expriment. Qualitativement, le CD22 et les SmIg sont jugés de faible expression quand la différence entre l’index de fluorescence du marqueur et l’index de fluorescence du contrôle est comprise entre 0,2 et 1 log (et de forte expression quand cette différence est supérieure à 1 log).

Résultats

Critères de classification cytologique

LLC typique cytologiquement

Monomorphisme cellulaire avec prédominance de lymphocytes matures (catégories I et II), proportion de lymphocytes clivés inférieure à 5 %, proportion de prolymphocytes inférieure à 5 %, proportion de cellules de la catégorie III inférieure à 5 %. Ces quatre critères doivent être réunis avec absence de cellules d’aspect lymphomateux.

LLC atypique cytologiquement

Perte du monomorphisme cellulaire avec une proportion de lymphocytes clivés supérieure à 5 % et/ou une proportion de prolymphocytes comprise entre 5 et 55 %, absence de cellules d’aspect lymphomateux.

Pathologies autre que LLC ou " non LLC "

Présence de cellules d’aspect lymphomateux sans notion de pourcentage, pathologie n’entrant pas dans les critères d’une LLC typique ou atypique.

Répartition des pathologies

Les diagnostics finaux de nos 92 patients, tenant compte à la fois de la cytologie, de l’immunophénotypage et des autres examens (clinique, anatomopathologique et cytogénétique), se répartissent en : - 72 LLC typiques ; - 7 LLC atypiques : 4 LLC ayant une proportion de plus de 5 % de lymphocytes clivés, soit 8 %, 11 %, 21 % et 26 % (figure 3a), 3 LLC ayant une proportion de prolymphocytes comprise entre 5 et 55 % (soit deux cas de LLC / PL et un cas de LLC à grandes cellules B) ; - 13 non LLC : 1 leucémie à prolymphocytes et 12 lymphomes non hodgkiniens (LNH) dont 4 à cellules clivées (figure 3b), 4 à cellules villeuses (lymphome splénique à lymphocytes villeux ou SLVL) et 4 à cellules que nous qualifieront de " prolymphocytoïdes " ou " paraimmunoblastiques " (taille moyenne à grande, rapport nucléo-cytoplasmique d’environ 0,6, chromatine non mottée laissant apparaître 1 ou 2 nucléoles bien visibles en position subcentrale ou parfois périphérique, cytoplasme acidophile ou légèrement basophile (figure 3c).

Analyse globale cytologique

Les ombres de Gumprecht sont des artefacts de frottis correspondant à des " fantômes " de cellules lymphoïdes. Elles sont en moyenne quantitativement plus nombreuses dans les LLC typiques par rapport aux LLC atypiques et aux non LLC. En considérant les ombres de Gumprecht comme une variable qualitative (absente pour une valeur seuil, définie sur des sujets témoins, inférieure à 10 pour 100 cellules lymphoïdes), nous retrouvons aussi des différences significatives entre les trois types de pathologies (test de Kruskal-Wallis ; p < 0,01). Les ombres de Gumprecht peuvent être considérées comme un " marqueur cytologique " de la LLC (tableau 2). Nous relevons dans cette étude quatre cas présentant des petits lymphocytes matures avec villosités parfois discrètes et une absence d’ombres de Gumprecht. Le diagnostic différentiel entre une LLC avec villosités dues à un artefact de frottis et une suspicion de lymphome splénique à lymphocytes villeux nécessite une analyse immunologique (tableau 3). L’association de villosités lymphocytaires, absence d’ombre de Gumprecht, score de Matutes ² 2 et splénomégalie signe le diagnostic de lymphome splénique à lymphocytes villeux. Analyse globale immunologique Tous les cas de LLC typiques ont un score de Matutes supérieur ou égal à 3, 96 % d’entre elles ont même un score supérieur ou égal à 4. L’immunophénotypage des LLC atypiques est plus hétérogène avec un score variant de 1 à 5 (tableau 4). Nos cas de LLC avec lymphocytes clivés ont toutes un score de 5, les LLC avec morphologie prolymphocytoïde ont des scores moins évocateurs ou même en défaveur d’une pathologie de type LLC.

Discussion

Les LLC typiques

Dans la majorité des cas de LLC, la morphologie des cellules circulantes est typique et conforme aux critères établis par le FAB. Tous les cas montrant un monomorphisme cellulaire avec lymphocytes matures accompagnés de moins de 5 % de prolymphocytes, de cellules clivées et/ou lymphoplasmocytaires et absence de cellules d’aspect lymphomateux ont conduit au diagnostic de LLC. La présence d’ombres de Gumprecht est également un critère fondamental du diagnostic cytologique, certes non absolu mais à la fois de bonne sensibilité et de bonne spécificité. Ces lymphocytes matures ont généralement un profil immunologique conforme aux critères établis par Matutes et Catovsky. En effet 72 % ont un score de 5 et 100 % un score ³ 3. L’association de ces résultats concordants permet de poser le diagnostic de LLC. En appliquant la classification cytologique FAB (en considérant comme typique nos deux cas de LLC avec moins de 15 % de cellules clivées), les LLC avec une morphologie typique sont plus fréquemment associées à un immunophénotypage typique (CD5 positif, CD23 positif, SmIg faible expression) que les LLC mixtes (89 % versus 50 %). Ces résultats rejoignent ceux de la littérature [3, 4]. L’étude de Shapiro montre que les patients atteints de LLC CD5 négative sans atypies cytologiques sont, par rapport à des sujets LLC CD5 positive, plus âgés avec un stade plus avancé au moment du diagnostic et moins hyperlymphocytaire [5], l’intérêt pronostique n’étant pas prouvé. Selon l’étude de Garant et Robillard, moins de 3 % des immunophénotypages de LLC typiques sont compatibles avec d’autres diagnostics d’hémopathies lymphoïdes chroniques tels que le lymphome non hodgkinien, la leucémie à prolymphocytes [3]. a b c

Les LLC à lymphocytes clivés

Dans notre étude, les LLC à lymphocytes clivés présentent cytologiquement des ombres de Gumprecht et immunologiquement les mêmes caractéristiques que les LLC typiques. L’analyse de la morphologie cellulaire a permis de faire le diagnostic différentiel entre ce type de LLC et les lymphomes non hodgkiniens à petites cellules clivées, diagnostic conforté par l’immunophénotypage. Pourtant, l’aspect cytologique à type de centrocytes dans les lymphomes à petites cellules n’est pas toujours aussi caractéristique et peut même simuler une LLC en raison de la petite taille des noyaux (CLL-like syndrome). La recherche d’ombres de Gumprecht et le typage lymphocytaire demeurent indispensables pour conclure [3].

Les LLC à morphologie prolymphocytoïde

Les cas de LLC atypiques, notamment avec des cellules d’aspect prolymphocytoïde, sont parfois difficiles à définir et le diagnostic différentiel avec une autre pathologie lymphoïde n’est pas toujours aisé. La présence d’ombres de Gumprecht dans le cadre de LLC atypique " prolymphocytoïde " versus non LLC n’est pas un critère aussi fiable que dans le cadre LLC typique versus non LLC. Le typage devient alors indispensable. Nous ne pouvons pas définir un profil immunologique type sur notre nombre restreint de patients. Il semble même se dégager une certaine hétérogénéité (CD5 ±, CD23 ±) avec toutefois un FMC7 positif et des SmIg de moyenne à forte expression. Seul le cas de LLC à grandes cellules associe la présence d’ombres de Gumprecht et un score de Matutes ³ 3 (score à 4). Plusieurs études retrouvent ces difficultés à définir immunologiquement les LLC mixtes avec un score de Matutes pouvant varier entre 0 et 5 (10 à 30 % des cas ont un score compris entre 0 et 1). Selon Garand, dans les LLC mixtes (notamment de type LLC / PL ou à grandes cellules), les immunophénotypages sont parfois compatibles avec d’autres diagnostics d’hémopathies lymphoïdes chroniques tels que lymphome non hodgkinien, leucémie à prolymphocytes. Ces typages litigieux sont de fréquence plus élevée que dans les LLC typiques. Cela suggère qu’une proportion de LLC mixte pourrait être par erreur classée en lymphome en phase leucémique ou apparentée à des leucémies à prolymphocytes [3]. Une proportion significative de leucémies à prolymphocytes montre un typage similaire à celui du lymphome du manteau (CD5 positif). De plus certaines cellules du manteau circulantes peuvent montrer une morphologie " prolymphocytoïde ". Ces cas de leucémies à prolymphocytes CD5 positives peuvent correspondre à un variant " prolymphocytoïde " du lymphome du manteau et semblent similaires au variant " blastoïde " du lymphome du manteau décrit dans la classification Real [3]. La combinaison CD18/CD54 semble toutefois discriminante entre les LLC typiques, les LLC mixtes et les lymphomes du manteau [6]. Ainsi, le pourcentage de cellules CD54 positives et leur intensité d’expression sont plus élevés dans les cas de lymphomes du manteau que dans les cas de LLC atypiques.

Utilité de chaque marqueur

Les deux marqueurs majeurs dans le diagnostic de LLC (typiques et mixtes) sont, dans notre étude, le CD23 et les SmIg (tableau 5). Selon Matutes, les LLC se caractérisent typiquement par les positivités du CD5 et du CD23 et la faible expression des SmIg [2]. La quasi-totalité des LLC (99 %) montre un CD22 de faible expression et seulement 78 % montre une négativité du FMC7. La contrepartie de la grande sensibilité du CD22 est une faible spécificité. Certains auteurs proposent de remplacer le CD22 par le CD79b pour augmenter la capacité à différencier la LLC des autres hémopathies lymphoïdes chroniques à cellules B [7]. Dans notre étude, seule la négativité du CD79b (moins de 30 % des cellules lymphoïdes l’exprimant) apporte une amélioration au diagnostic de ces hémopathies autres que la LLC. En association avec le CD19, la négativité du CD79b et la faible expression du CD20 éliminent le diagnostic de non LLC, le bémol à apporter à ce diagnostic d’exclusion de spécificité absolue est une sensibilité relativement faible. Mac Carron retrouve une forte corrélation entre le diagnostic de LLC et une faible intensité du CD79b, du CD20 et des SmIg [8].

Autres approches

De nombreuses publications montrent sur des critères biologiques, cytogénétiques, cliniques que les LLC avec morphologie typique et atypique sont deux entités différentes, de pronostics différents. Les atypies cellulaires (souvent associées à des atypies caryotypiques et immunophénotypiques) sont signes de mauvais pronostic [9-11]. Dans les LLC, il existe une corrélation entre le caryotype, la morphologie et l’immunophénotypage. Les caryotypes normaux ou avec l’anomalie 13q14 sont associés à une morphologie et un immunophénotypage considérés comme typique de la LLC. La trisomie 12 est associée à une morphologie et un immunophénotypage atypiques [12]. La translocation t (11;14) identifie une entité de LLC aux profils cytologiques, immunologiques et cytogénétiques distincts des autres LLC mais proches des lymphomes du manteau [13].

CONCLUSION

En pratique, la LLC-B typique représente la grande majorité des hémopathies lymphoïdes chroniques B à dissémination sanguine (80 à 90 %) et la cytologie lymphoïde sanguine reste à la base de tout diagnostic. Dans la LLC typique avec ombres de Gumprecht et la leucémie à tricholeucocytes (" lymphocyte chevelu "), la cytologie peut être suffisante à elle seule (figure 4). L’immunophénotypage n’a pas de valeur pronostique prouvée dans les cas de LLC typiques cytologiquement CD5 négatives. L’immunophénotypage est indispensable dans les formes atypiques pour exclure une pathologie lymphoïde autre que la LLC. L’association cytologie-immunophénotypage est suffisante pour le diagnostic d’orientation entre LLC et lymphomes à cellules clivées et entre LLC avec villosités dues à un artefact de frottis et lymphome splénique à lymphocytes villeux. En revanche, le diagnostic différentiel entre LLC avec prolymphocytes et lymphomes (notamment lymphome du manteau et lymphome des zones marginales sans lymphocytes villeux) est pluridisciplinaire : cytologie, immunologie, anatomopathologie, cytogénétique et clinique. Le lymphome des zones marginales sans lymphocytes villeux doit être évoqué devant toute LLC atypique à forme splénomégalique, en particulier si elle est CD5 négative. La définition précise de ces entités, grâce à une démarche diagnostique pluridisciplinaire coordonnée, conduit à établir des facteurs pronostiques et une stratégie thérapeutique très particulière pour chacune d’entre elles.

REFERENCES

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